Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Toxoplasma gondii е вътреклетъчен протозоен паразит, който модулира микросредата на заразения гостоприемник и е известно, че е свързан с честотата на растеж на мозъчен тумор.В това проучване ние предполагаме, че екзозомалната miRNA-21 от инфекция с Toxoplasma насърчава растежа на мозъчния тумор.Бяха характеризирани екзозоми от инфектирана с Toxoplasma BV2 микроглия и беше потвърдена интернализация на U87 глиомни клетки.Профилите на експресия на екзозомална микроРНК бяха анализирани с помощта на масиви от микроРНК и микроРНК-21A-5p, свързани с Toxoplasma gondii и сортиране на тумори.Ние също така изследвахме нивата на mRNA на тумор-асоциирани гени в U87 глиомни клетки чрез промяна на нивата на miR-21 в екзозомите и ефекта на екзозомите върху пролиферацията на човешки U87 глиомни клетки.В екзозоми на U87 глиомни клетки, заразени с Toxoplasma gondii, експресията на микроРНК-21 се повишава и активността на антитуморните гени (FoxO1, PTEN и PDCD4) се намалява.Произведени от BV2 екзозоми, заразени с Toxoplasma, индуцират пролиферация на U87 глиомни клетки.Екзозомите индуцират растеж на U87 клетки в миши туморен модел.Ние предполагаме, че увеличеният екзозомален miR-21 в инфектирана с токсоплазма BV2 микроглия може да играе важна роля като стимулатор на клетъчния растеж в U87 глиомни клетки чрез понижаване на антитуморните гени.
Изчислено е, че повече от 18,1 милиона случая на рак в напреднал стадий са диагностицирани по света през 2018 г., като всяка година се диагностицират около 297 000 тумора на централната нервна система (1,6% от всички тумори)1.Предишни изследвания показват, че рисковите фактори за развитие на човешки мозъчни тумори включват различни химически продукти, фамилна анамнеза и йонизиращо лъчение от терапевтично и диагностично оборудване за глава.Точната причина за тези злокачествени заболявания обаче не е известна.Приблизително 20% от всички ракови заболявания в света се причиняват от инфекциозни агенти, включително вируси, бактерии и паразити3,4.Инфекциозните патогени нарушават генетичните механизми на клетката гостоприемник, като възстановяване на ДНК и клетъчния цикъл, и могат да доведат до хронично възпаление и увреждане на имунната система5.
Инфекциозните агенти, свързани с човешкия рак, са най-често срещаните вирусни патогени, включително човешки папиломавируси и вируси на хепатит B и C.Паразитите също могат да играят потенциална роля в развитието на човешки рак.Няколко вида паразити, а именно Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis и Hymenolepis nana, са замесени в различни видове човешки рак 6,7,8.
Toxoplasma gondii е вътреклетъчен протозой, който регулира микросредата на заразените клетки гостоприемници.Счита се, че този паразит заразява приблизително 30% от световното население, излагайки цялото население на риск9,10.Toxoplasma gondii може да зарази жизненоважни органи, включително централната нервна система (ЦНС), и да причини сериозни заболявания като фатален менингит и енцефалит, особено при имунокомпрометирани пациенти9.Въпреки това, Toxoplasma gondii може също да промени средата на заразения гостоприемник чрез модулиране на клетъчния растеж и имунните отговори при имунокомпетентни индивиди, което води до поддържане на асимптоматична хронична инфекция9,11.Интересно е, че като се има предвид връзката между разпространението на T. gondii и заболеваемостта от мозъчен тумор, някои доклади предполагат, че in vivo промените в околната среда на гостоприемника, дължащи се на хронична инфекция с T. gondii, приличат на туморната микросреда.
Екзозомите са известни като междуклетъчни комуникатори, които доставят биологично съдържание, включително протеини и нуклеинови киселини, от съседни клетки 16, 17.Екзозомите могат да повлияят на свързаните с тумора биологични процеси като антиапоптоза, ангиогенеза и метастази в туморната микросреда.По-специално, miPHK (miPHK), малки некодиращи РНК с дължина около 22 нуклеотида, са важни пост-транскрипционни генни регулатори, които контролират повече от 30% от човешката иРНК чрез miRNA-индуцирания заглушаващ комплекс (miRISC).Toxoplasma gondii може да наруши биологичните процеси чрез контролиране на експресията на miRNA в заразени гостоприемници.МиРНК на гостоприемника съдържат важни сигнали за регулиране на биологичните процеси на гостоприемника, за да се постигне стратегията за оцеляване на паразита.По този начин, изучаването на промените в профила на миРНК на гостоприемника при инфекция с T. gondii може да ни помогне да разберем по-ясно взаимодействието между гостоприемника и T. gondii.Наистина, Thirugnanam et al.15 предполагат, че T. gondii насърчава мозъчната карциногенеза, като променя експресията си върху специфични миРНК на гостоприемника, свързани с растежа на тумора, и открива, че T. gondii може да причини глиоми при експериментални животни.
Това изследване се фокусира върху промяната на екзозомалната miR-21 в микроглията на гостоприемника, заразена с Toxoplasma BV2.Наблюдавахме възможна роля на променен екзозомален miR-21 в растежа на U87 глиомни клетки поради задържането в ядрото на FoxO1/p27, което е целта на свръхекспресиран miR-21.
Екзозомите, получени от BV2, бяха получени чрез диференциално центрофугиране и валидирани чрез различни методи за предотвратяване на замърсяване с клетъчни компоненти или други везикули.SDS-полиакриламидна гел електрофореза (SDS-PAGE) показа различни модели между протеини, извлечени от BV2 клетки и екзозоми (Фигура 1А), и пробите бяха оценени за наличието на Alix, който беше анализиран чрез Western blotting на екзозомни протеинови маркери в .Маркирането на Alix беше открито в екзозомни протеини, но не и в BV2 клетъчни лизатни протеини (фиг. 1B).В допълнение, пречистена РНК от екзозоми, получени от BV2, се анализира с помощта на биоанализатор.18S и 28S рибозомни субединици рядко се наблюдават в миграционния модел на екзозомна РНК, което показва надеждна чистота (Фигура 1C).И накрая, трансмисионната електронна микроскопия показа, че наблюдаваните екзозоми са с размер около 60–150 nm и имат подобна на чаша структура, типична за морфологията на екзозомите (фиг. 1D).
Характеризиране на екзозоми, получени от BV2 клетки.(A) Страница с информационен лист за безопасност.Протеините се изолират от BV2 клетки или екзозоми, получени от BV2.Протеиновите модели се различават между клетките и екзозомите.(B) Western blot анализ на екзозомален маркер (Alix).(C) Оценка на пречистена РНК от BV2 клетки и екзозоми, получени от BV2, с помощта на биоанализатор.По този начин, 18S и 28S рибозомни субединици в BV2 клетки рядко се откриват в екзозомна РНК.(D) Трансмисионна електронна микроскопия показа, че екзозомите, изолирани от BV2 клетки, са отрицателно оцветени с 2% уранил ацетат.Екзозомите са с размер приблизително 60-150 nm и са с форма на чаша (Song and Jung, непубликувани данни).
Клетъчна интернализация на екзозоми, получени от BV2, в U87 човешки глиомни клетки се наблюдава с помощта на конфокална микроскопия.Маркираните с PKH26 екзозоми са локализирани в цитоплазмата на U87 клетки.Ядрата бяха оцветени с DAPI (фиг. 2А), което показва, че екзозомите, получени от BV2, могат да бъдат интернализирани от клетките гостоприемници и да повлияят на околната среда на реципиентните клетки.
Интернализация на екзозоми, получени от BV2, в U87 глиомни клетки и екзозоми, получени от BV2, инфектирани с Toxoplasma RH, индуцират пролиферация на U87 глиомни клетки.(A) Екзозоми, погълнати от U87 клетки, измерени чрез конфокална микроскопия.U87 глиомни клетки се инкубират с екзозоми, маркирани с PKH26 (червено) или без контрола за 24 часа.Ядрата се оцветяват с DAPI (синьо) и след това се наблюдават под конфокален микроскоп (скала: 10 μm, x 3000).(B) U87 глиомна клетъчна пролиферация се определя чрез анализ на клетъчна пролиферация.U87 глиомни клетки бяха третирани с екзозоми за посоченото време. *P <0,05 беше получено чрез t теста на Student. *P <0,05 беше получено чрез t теста на Student. *P < 0,05 получено по t-критерия Стюдента. *P <0,05 чрез t-теста на Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P < 0,05, получен с помощта на t-критерия Стюдента. * P <0,05, получено с помощта на t-теста на Student.
След потвърждаване на интернализацията на екзозоми, получени от BV2, в U87 глиомни клетки, ние проведохме анализи на клетъчна пролиферация, за да изследваме ролята на екзозоми, получени от BV2, получени от токсоплазма, в развитието на човешки глиомни клетки.Третирането на U87 клетки с екзозоми от T. gondii-инфектирани BV2 клетки показа, че T. gondii-инфектирани BV2-получени екзозоми причиняват значително по-висока пролиферация на U87 клетки в сравнение с контролата (Фиг. 2B).
В допълнение, растежът на U118 клетки има същите резултати като U87, тъй като екзозомите, стимулирани от Toxoplasma, причиняват най-високи нива на пролиферация (данните не са показани).Въз основа на тези данни можем да посочим, че екзозомите, получени от BV2, инфектирани с токсоплазма, играят важна роля в пролиферацията на глиомни клетки.
За да изследваме ефекта на инфектираните с Toxoplasma екзозоми, получени от BV2, върху развитието на тумора, ние инжектирахме U87 глиомни клетки в голи мишки за модел на ксенографт и инжектирахме екзозоми, получени от BV2, или инфектирани с RH екзозоми, получени от BV2.След като туморите станаха очевидни след 1 седмица, всяка експериментална група от 5 мишки беше разделена според размера на тумора, за да се определи същата начална точка, и размерът на тумора беше измерен в продължение на 22 дни.
При мишки с U87 ксенотрансплантатен модел се наблюдават значително по-големи размери и тегло на тумора в RH-инфектираната с BV2 екзозомна група на ден 22 (фиг. 3A, B).От друга страна, няма значителна разлика в размера на тумора между групата с екзозома, получена от BV2, и контролната група след лечение с екзозома.В допълнение, мишки, инжектирани с глиомни клетки и екзозоми, визуално показват най-големия обем на тумора в групата на RH-инфектирани екзозоми, получени от BV2 (фиг. 3C).Тези резултати показват, че BV2-получени Toxoplasma-инфектирани екзозоми индуцират растеж на глиома в миши туморен модел.
Онкогенеза (AC) на екзозоми, получени от BV2, в миши модел на ксенографт U87.Размерът на тумора (A) и теглото (B) са значително увеличени при BALB/c голи мишки, третирани с RH-инфектирани екзозоми, получени от BV2.BALB/c голи мишки (C) бяха инжектирани подкожно с 1 х 107 U87 клетки, суспендирани в Matrigel смес.Шест дни след инжектирането, 100 μg екзозоми, получени от BV2, бяха третирани в мишки.Размерът и теглото на тумора бяха измерени съответно в посочените дни и след умъртвяването. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
Данните показват, че 37 miPHKs (16 свръхекспресирани и 21 понижено експресиране), свързани с имунитета или развитието на тумор, са значително променени в микроглия след инфекция с щам Toxoplasma RH (фиг. 4A).Относителните нива на експресия на miR-21 сред променени miRNAs бяха потвърдени чрез RT-PCR в реално време в екзозоми, получени от BV2, екзозоми, третирани с BV2 и U87 клетки.Експресията на miR-21 показва значително увеличение на екзозомите от BV2 клетки, заразени с Toxoplasma gondii (RH щам) (Фиг. 4B).Относителните нива на експресия на miR-21 в BV2 и U87 клетки се повишават след поглъщане на променени екзозоми (Фиг. 4В).Относителните нива на експресия на miR-21 в мозъчните тъкани на пациенти с тумори и мишки, заразени с Toxoplasma gondii (щам ME49) са по-високи, отколкото при контролите, съответно (фиг. 4C).Тези резултати корелират с разликите между нивата на експресия на прогнозирани и потвърдени микроРНК in vitro и in vivo.
Промени в експресията на екзозомален miP-21a-5p в микроглия, заразена с Toxoplasma gondii (RH).(A) Демонстрира значителни промени в siRNA, свързани с имунитет или развитие на тумор след инфекция с T. gondii RH.(B) Относителни нива на експресия на miR-21 бяха открити чрез RT-PCR в реално време в екзозоми, получени от BV2, третирани с BV2 екзозоми и U87 клетки.(C) Относителни нива на експресия на miR-21 бяха открити в мозъчните тъкани на пациенти с тумор (N=3) и мишки, заразени с Toxoplasma gondii (щам ME49) (N=3). *P <0,05 беше получено чрез t теста на Student. *P <0,05 беше получено чрез t теста на Student. *P < 0,05 е получено с помощта на t-критерия Стюдента. *P <0,05 беше получено с помощта на t-теста на Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, получен с помощта на t-критерия Стюдента. * P <0,05, получено с помощта на t-теста на Student.
Екзозоми от RH-инфектирани BV2 клетки доведоха до растеж на глиоми in vivo и in vitro (фиг. 2, 3).За да открием съответните иРНК, ние изследвахме нивата на иРНК на антитуморни целеви гени, вилица O1 (FoxO1), PTEN и програмирана клетъчна смърт 4 (PDCD4) в U87 клетки, заразени с екзозоми, получени от BV2 или RH BV2.Анализът на биоинформатика показа, че няколко гена, свързани с тумора, включително гените FoxO1, PTEN и PDCD4, имат miR-2121,22 места за свързване.Нивата на тРНК на антитуморни целеви гени бяха намалени в RH-инфектирани екзозоми, получени от BV2, в сравнение с екзозоми, получени от BV2 (фиг. 5А).FoxO1 показва намалени нива на протеин в RH-инфектирани екзозоми, получени от BV2, в сравнение с екзозоми, получени от BV2 (Фигура 5B).Въз основа на тези резултати можем да потвърдим, че екзозомите, получени от RH-инфектиран BV2, регулират надолу антионкогенните гени, запазвайки ролята си в растежа на тумора.
Инфектирани с Toxoplasma RH екзозоми, получени от BV2, индуцират потискане на антитуморни гени в U87 глиомни клетки от инфектирани с Toxoplasma RH екзозоми, получени от BV2.(A) PCR в реално време на FoxO1, PTEN и PDCD4 експресия в екзозоми, получени от T. gondii RH-инфектиран BV2 в сравнение с PBS екзозоми.β-актин иРНК се използва като контрола.(B) Експресията на FoxO1 се определя чрез Western blotting и данните от денситометрията се оценяват статистически с помощта на програмата ImageJ. *P <0,05 беше получено чрез t теста на Student. *P <0,05 беше получено чрез t теста на Student. *P < 0,05 е получено с помощта на t-критерия Стюдента. *P <0,05 беше получено с помощта на t-теста на Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, получен с помощта на t-критерия Стюдента. * P <0,05, получено с помощта на t-теста на Student.
За да се разбере ефектът на miP-21 в екзозомите върху свързаната с тумор генна регулация, U87 клетки бяха трансфектирани с инхибитор на miP-21, използвайки Lipofectamine 2000 и клетките бяха събрани 24 часа след трансфекцията.Нивата на експресия на FoxO1 и p27 в клетки, трансфектирани с инхибитори на miR-21, бяха сравнени с клетки, третирани с екзозоми, получени от BV2, използвайки qRT-PCR (фиг. 6A, B).Трансфекцията на miR-21 инхибитора в U87 клетки значително намалява експресията на FoxO1 и р27 (ФИГ. 6).
RH-инфектиран екзозомален BV2-получен miP-21 променя експресията на FoxO1/p27 в U87 глиомни клетки.U87 клетки бяха трансфектирани с miP-21 инхибитор, използвайки Lipofectamine 2000 и клетките бяха събрани 24 часа след трансфекцията.Нивата на експресия на FoxO1 и p27 в клетки, трансфектирани с инхибитори на miR-21, бяха сравнени с нивата в клетки, третирани с екзозоми, получени от BV2, използвайки qRT-PCR (A, B).
За да избегне имунния отговор на гостоприемника, паразитът Toxoplasma се трансформира в тъканна киста.Те паразитират в различни тъкани, включително мозъка, сърцето и скелетните мускули, през целия живот на гостоприемника и модулират имунния отговор на гостоприемника.В допълнение, те могат да регулират клетъчния цикъл и апоптозата на клетките гостоприемници, насърчавайки тяхната пролиферация14,24.Toxoplasma gondii инфектира предимно дендритни клетки на гостоприемника, неутрофили и моноцитна/макрофагова линия, включително мозъчна микроглия.Toxoplasma gondii индуцира диференциацията на макрофагите от фенотипа M2, повлиява заздравяването на рани след патогенна инфекция и също така се свързва с хиперваскуларизация и грануломатозна фиброза.Тази поведенческа патогенеза на инфекция с Toxoplasma може да бъде свързана с маркери, свързани с развитието на тумор.Враждебната среда, регулирана от Toxoplasma, може да наподобява съответния предрак.Следователно може да се предположи, че инфекцията с токсоплазма трябва да допринесе за развитието на мозъчни тумори.Всъщност, високи нива на инфекция с токсоплазма са докладвани в серума на пациенти с различни мозъчни тумори.В допълнение, Toxoplasma gondii може да бъде друг канцерогенен ефектор и да действа синергично, за да помогне на други инфекциозни канцерогени да развият мозъчни тумори.В тази връзка си струва да се отбележи, че P. falciparum и вирусът на Epstein-Barr синергично допринасят за образуването на лимфома на Burkitt.
Ролята на екзозомите като регулатори в областта на изследването на рака е широко изследвана.Въпреки това, ролята на екзозомите между паразити и заразени гостоприемници остава слабо разбрана.Досега различни регулатори, включително секретирани протеини, са обяснили биологичните процеси, чрез които протозойните паразити се противопоставят на атаката на гостоприемника и поддържат инфекцията.Напоследък има нарастваща концепция, че свързаните с протозоите микровезикули и техните микроРНК взаимодействат с клетките гостоприемници, за да създадат благоприятна среда за тяхното оцеляване.Следователно са необходими допълнителни проучвания, за да се открие връзката между променените екзозомални miPHK и пролиферацията на глиомни клетки.Промяната на микроРНК (клъстерни гени miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 и miR-17-92) се свързва с промотора STAT3 в инфектирани с токсоплазма човешки макрофаги, регулира се и индуцира анти -апоптоза в отговор на инфекция с Toxoplasma gondii 29 .Инфекцията с токсоплазма повишава експресията на miR-17-5p и miR-106b-5p, които са свързани с няколко хиперпролиферативни заболявания 30 .Тези данни предполагат, че миРНК на гостоприемника, регулирани от инфекция с Toxoplasma, са важни молекули за оцеляването на паразита и патогенезата в биологичното поведение на гостоприемника.
Променените miPHK могат да повлияят на различни типове поведение по време на инициирането и прогресирането на злокачествени клетки, включително глиоми: самодостатъчност на сигнали за растеж, нечувствителност към сигнали, инхибиращи растежа, избягване на апоптоза, неограничен репликативен потенциал, ангиогенеза, инвазия и метастази и възпаление.В глиома, променени miRNAs са идентифицирани в няколко проучвания за профилиране на експресията.
В настоящото изследване ние потвърдихме високи нива на експресия на miPHK-21 в инфектирани с токсоплазма клетки гостоприемници.miR-21 е идентифициран като една от най-често свръхекспресираните микроРНК в солидни тумори, включително глиоми, 33 и неговата експресия корелира със степента на глиома.Натрупващите се доказателства предполагат, че miR-21 е нов онкоген, който действа като антиапоптотичен фактор в растежа на глиома и е силно свръхекспресиран в тъканите и плазмата на злокачествени заболявания на човешкия мозък.Интересно е, че инактивирането на miR-21 в глиомни клетки и тъкани задейства инхибирането на клетъчната пролиферация поради апоптоза, зависима от каспаза.Биоинформатичният анализ на miR-21 предсказани мишени разкрива множество туморни супресорни гени, свързани с пътищата на апоптоза, включително програмирана клетъчна смърт 4 (PDCD4), тропомиозин (TPM1), PTEN и forkhead box O1 (FoxO1), с мястото на свързване на miR-2121..22.38.
FoxO1, като един от транскрипционните фактори (FoxO), участва в развитието на различни видове човешки рак и може да регулира експресията на туморни супресорни гени като p21, p27, Bim и FasL40.FoxO1 може да свързва и активира инхибитори на клетъчния цикъл като p27, за да потисне клетъчния растеж.Освен това, FoxO1 е ключов ефектор на PI3K/Akt сигнализиране и регулира много биологични процеси като прогресия на клетъчния цикъл и клетъчна диференциация чрез активиране на p2742 транскрипция.
В заключение, ние вярваме, че екзозомалната miR-21, получена от инфектирана с Toxoplasma микроглия, може да играе важна роля като регулатор на растежа на глиомни клетки (фиг. 7).Необходими са обаче допълнителни проучвания, за да се намери пряка връзка между екзозомалната miR-21, променената инфекция с Toxoplasma и растежа на глиома.Очаква се тези резултати да осигурят отправна точка за изследване на връзката между инфекцията с Toxoplasma и честотата на глиома.
В това изследване е предложена схематична диаграма на механизма на карциногенезата на глиома (мозъка).Авторът рисува в PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Всички експериментални протоколи в това проучване, включително използването на животни, са в съответствие със стандартните етични насоки на Комитета за грижа за животните и потребителите на Националния университет в Сеул и са одобрени от Институционалния съвет за преглед на Медицинския факултет на Националния университет в Сеул (IRB номер SNU- 150715).-2).Всички експериментални процедури бяха проведени в съответствие с препоръките на ARRIVE.
BV2 миши микроглии и U87 човешки глиомни клетки бяха култивирани в Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) и среда на Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), съответно, всяка съдържаща 10% фетален говежди серум, 4 mM l- глутамин, 0.2 mM пеницилин и 0.05 mM стрептомицин.Клетките се култивират в инкубатор с 5% СО2 при 37°С.Друга клетъчна линия на глиома, U118, беше използвана за сравнение с U87 клетки.
За да се изолират екзозоми от инфектирани с T. gondii щамове RH и ME49, тахизоитите на T. gondii (щам RH) бяха събрани от коремната кухина на 6-седмични BALB/c мишки, инжектирани 3-4 дни преди това.Тахизоитите се промиват три пъти с PBS и се пречистват чрез центрофугиране в 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.За да се получат тахизоити от щам ME49, BALB/c мишки се инжектират интраперитонеално с 20 тъканни кисти и тахизоитната трансформация в кисти се събира чрез промиване на коремната кухина на 6-8-ия ден след инфекцията (PI).Мишки, заразени с PBS.Тахизоитите ME49 се отглеждат в клетки, допълнени със 100 μg/ml пеницилин (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml стрептомицин (Gibco/BRL) и 5% фетален говежди серум (Lonza, Walkersville, MD) .., САЩ) при 37 °C и 5% въглероден диоксид.След култивиране в клетки на Vero, тахизоитите ME49 бяха прекарани два пъти през игла с размер 25 и след това през филтър от 5 µm за отстраняване на остатъци и клетки.След промиване тахизоитите се ресуспендират в PBS44.Тъканните кисти на Toxoplasma gondii щам ME49 се поддържат чрез интраперитонеално инжектиране на кисти, изолирани от мозъка на заразени C57BL/6 мишки (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Корея).Мозъците на инфектирани с ME49 мишки се събират след 3 месеца PI и се смилат под микроскоп за изолиране на кисти.Заразените мишки се държат при специални условия без патогени (SPF) в Медицинския факултет на Националния университет в Сеул.
Общата РНК се екстрахира от екзозоми, получени от BV2, BV2 клетки и тъкани, като се използва miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) съгласно инструкциите на производителя, включително времето за инкубация за етапа на елуиране.Концентрацията на РНК се определя на спектрофотометър NanoDrop 2000.Качеството на РНК микрочипове беше оценено с помощта на биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Холандия).
DMEM с 10% беден на екзозома FBS се приготвя чрез ултрацентрофугиране при 100 000 g за 16 часа при 4°C и се филтрува през 0.22 µm филтър (Nalgene, Rochester, NY, USA).BV2 клетки, 5 × 105, се култивират в DMEM, съдържащ 10% FBS с изчерпани екзозоми и 1% антибиотици при 37°C и 5% CO2.След 24 часа инкубация към клетките се добавят тахизоити от щам RH или ME49 (MOI = 10) и неинвазиращите паразити се отстраняват в рамките на един час и се пълнят отново с DMEM.Екзозомите от BV2 клетки бяха изолирани чрез модифицирано диференциално центрофугиране, най-широко използваният метод.Ресуспендирайте утайката от екзозома в 300 µl PBS за РНК или протеинов анализ.Концентрацията на изолирани екзозоми се определя с помощта на комплект за анализ на BCA протеин (Pierce, Rockford, IL, USA) и спектрофотометър NanoDrop 2000.
Утайки от BV2 клетки или екзозоми, получени от BV2, се лизират в PRO-PREP™ протеинов екстракционен разтвор (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Корея) и протеините се зареждат върху Coomassie брилянтно синьо, оцветени с 10% SDS полиакриламидни гелове.В допълнение, протеините се прехвърлят към PVDF мембрани за 2 часа.Western блотовете бяха валидирани с помощта на антитялото Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) като екзозомален маркер.HRP-конюгиран кози анти-миши IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) и LAS-1000 плюс луминисцентен анализатор на изображения (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) бяха използвани като вторично антитяло..Извършена е трансмисионна електронна микроскопия за изследване на размера и морфологията на екзозомите.Екзозомите, изолирани от BV2 клетки (6.40 µg/µl), се приготвят върху покрити с въглерод мрежи и се оцветяват отрицателно с 2% уранил ацетат за 1 минута.Подготвените проби бяха наблюдавани при ускоряващо напрежение от 80 kV с помощта на JEOL 1200-EX II (Токио, Япония), оборудван с ES1000W Erlangshen CCD камера (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Произведените от BV2 екзозоми се оцветяват с помощта на PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) за 15 минути при стайна температура.U87 клетки, 2 × 105, с маркирани с PKH26 екзозоми (червени) или без екзозоми като отрицателна контрола, се инкубират при 37 ° С за 24 часа в 5% CO2 инкубатор.U87 клетъчните ядра бяха оцветени с DAPI (синьо), U87 клетки бяха фиксирани в 4% параформалдехид за 15 минути при 4 ° С и след това анализирани в Leica TCS SP8 STED CW конфокална микроскопска система (Leica Microsystems, Манхайм, Германия).наблюдаем.
cDNA се синтезира от siRNA, като се използва Mir-X siRNA синтез на първа верига и SYBR qRT-PCR комплект (Takara Bio Inc., Shiga, Япония).Количественият PCR в реално време се извършва с помощта на iQ5 система за откриване на PCR в реално време (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, САЩ), използвайки праймери и шаблони, смесени със SYBR Premix.ДНК се амплифицира за 40 цикъла на денатурация при 95°C за 15 s и отгряване при 60°C за 60 s.Данните от всяка PCR реакция бяха анализирани с помощта на модула за анализ на данни на софтуера за оптична система iQ™5 (Bio-Rad).Относителните промени в генната експресия между избрани целеви гени и β-актин/siRNA (и U6) бяха изчислени с помощта на метода на стандартната крива.Използваните праймерни последователности са показани в таблица 1.
3 x 104 U87 глиомни клетки се посяват в 96-ямкови плаки и се смесват с инфектирани с токсоплазма екзозоми, получени от BV2 (50 μg/mL) или непулсови екзозоми, получени от BV2 (50 μg/mL) като контроли на 12, 18 и 36 часа .Скоростта на клетъчна пролиферация се определя с помощта на комплект за броене на клетки-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (допълнителни фигури S1-S3) 46.
5-седмични женски голи мишки BALB/c бяха закупени от Orient Bio (Seongnam-si, Южна Корея) и държани индивидуално в стерилни клетки при стайна температура (22 ± 2 ° C) и влажност (45 ± 15 ° C).%) при стайна температура (22±2°C) и влажност (45±15%).12-часов цикъл на светлина и 12-часов цикъл на тъмнина бяха извършени под SPF (Център за животни към Медицинския факултет на Сеулския национален университет).Мишките бяха произволно разделени на три групи от по 5 мишки всяка и всички групи бяха инжектирани подкожно с 400 ml PBS, съдържащ 1 х 107 U87 глиомни клетки и BD Matrigel™ с намален растежен фактор (BD Science, Маями, Флорида, САЩ).Шест дни след инжектирането на тумора, 200 mg екзозоми, получени от BV2 клетки (с/без Toxoplasma инфекция) бяха инжектирани в мястото на тумора.Двадесет и два дни след инфектирането с тумора размерът на тумора на мишките във всяка група се измерва с дебеломер три пъти седмично и обемът на тумора се изчислява по формулата: 0,5 × (ширина) × 2 × дължина.
Анализ на експресия на микроРНК с помощта на miRCURYTM LNA miRNA масив, 7-мо поколение има, mmu и rno масиви (EXIQON, Vedbaek, Дания), обхващащ 1119 добре охарактеризирани мишки сред 3100 сонди за улавяне на miRNA на хора, мишки и плъхове.По време на тази процедура, 250 до 1000 ng от общата РНК се отстранява от 5'-фосфата чрез третиране с телешка чревна алкална фосфатаза, последвано от маркиране с Hy3 зелена флуоресцентна боя.Маркираните проби след това се хибридизират чрез зареждане на слайдове с микрочипове, като се използва комплект за хибридизационна камера (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ) и комплект за слайдове за хибридизация (Agilent Technologies).Хибридизацията се провежда в продължение на 16 часа при 56°С, след което микрочиповете се промиват в съответствие с препоръките на производителя.След това обработените слайдове с микрочипове бяха сканирани с помощта на система за сканиране на микрочипове Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Сканираните изображения бяха импортирани с помощта на софтуера Agilent Feature Extraction версия 10.7.3.1 (Agilent Technologies) и интензитетът на флуоресценция на всяко изображение беше количествено определен с помощта на съответния GAL файл на модифицирания протокол Exiqon.Данните от микрочипове за настоящото изследване са депозирани в базата данни GEO под номер за достъп GPL32397.
Експресионните профили на зрели екзозомални miRNAs в микроглия на RH или ME49 щамове, заразени с Toxoplasma, бяха анализирани с помощта на различни мрежови инструменти.miRNAs, свързани с развитието на тумора, бяха идентифицирани с помощта на miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) и филтрирани с нормализиран интензитет на сигнала (log2) по-голям от 8.0.Сред miRNAs, диференциално експресираните miPHKs бяха установени като повече от 1,5 пъти променени чрез филтърен анализ на miRNAs, променени от RH или ME49 щамове, заразени с T. gondii.
Клетките се посяват в плаки с шест ямки (3 х 105 клетки/ямка) в opti-MEM (Gibco, Carlsbad, СА, САЩ), като се използва Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, СА, САЩ).Трансфектираните клетки се култивират в продължение на 6 часа и след това средата се променя на свежа пълна среда.Клетките се събират 24 часа след трансфекцията.
Статистическият анализ беше извършен главно с помощта на t-тест на Student със софтуер Excel (Microsoft, Вашингтон, окръг Колумбия, САЩ).За експериментален анализ на животни беше извършена двупосочна ANOVA с помощта на софтуера Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-стойности < 0,05 се считат за статистически значими. P-стойности <0,05 се считат за статистически значими. Значения P <0,05 се считат за статистически значими. P стойностите <0,05 се считат за статистически значими. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 се считат за статистически значими. P стойностите <0,05 се считат за статистически значими.
Всички експериментални протоколи, използвани в това проучване, бяха одобрени от Институционалния съвет за преглед на Медицинския факултет на Националния университет в Сеул (IRB номер SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Прогнозна глобална заболеваемост и смъртност от рак през 2018 г.: източници и методи на GLOBOCAN.Интерпретация.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Вникване в рисковите фактори на мозъчните тумори и техните терапевтични интервенции. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Вникване в рисковите фактори на мозъчните тумори и техните терапевтични интервенции.Rashid, S., Rehman, K. и Akash, MS Преглед на рисковите фактори за мозъчни тумори и големи терапевтични интервенции. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Задълбочено разбиране на рисковите фактори за мозъчен тумор и терапевтичните интервенции.Rashid, S., Rehman, K. и Akash, MS Преглед на рисковите фактори за мозъчни тумори и големи терапевтични интервенции.Биомедицинска наука.фармацевт.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Бактериално-вирусни взаимодействия при рак на човешкия храносмилателен и женски генитален тракт: Обобщение на епидемиологични и лабораторни доказателства. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Бактериално-вирусни взаимодействия при рак на човешкия храносмилателен и женски генитален тракт: Обобщение на епидемиологични и лабораторни доказателства.Kato I., Zhang J. и Sun J. Бактериално-вирусни взаимодействия при рак на човешкия стомашно-чревен тракт и женския генитален тракт: обобщение на епидемиологични и лабораторни данни. Като, И., Джан, Дж. и Сун, Дж. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Бактерио-вирусно взаимодействие в храносмилането на човешката устна кухина и женския репродуктивен тракт: обобщение на популярната наука за болестта и лабораторни доказателства.Kato I., Zhang J. и Sun J. Бактериално-вирусни взаимодействия при човешки стомашно-чревен рак и женски генитален рак: обобщение на епидемиологични и лабораторни данни.Рак 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL От инфекция до рак: Как ДНК туморните вируси променят централния въглероден и липиден метаболизъм на клетката гостоприемник. Magon, KL & Parish, JL От инфекция до рак: Как ДНК туморните вируси променят централния въглероден и липиден метаболизъм на клетката гостоприемник.Mahon, KL и Parish, JL Огнева инфекция към рак: как базираните на ДНК туморни вируси променят централния въглероден и липиден метаболизъм на клетката гостоприемник. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：ДНК 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL От инфекция до рак: как ДНК туморните вируси променят централния въглероден и липиден метаболизъм на клетката гостоприемник.Махон, К. Л. и Париш, Дж. Л. Запалва инфекцията до рак: как ДНК туморните вируси променят централния въглероден и липиден метаболизъм в клетките гостоприемници.Отворена биология.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Катехол естрогени на шистозоми и чернодробни метили и рак, свързан с хелминти.отпред.горещо отвътре.5, 444 (2014).