Giardia duodenum е паразитен организъм, който причинява лямблиоза, чревна инфекция, особено често срещана при малки деца с клинични признаци на диария.По-рано сме докладвали, че извънклетъчният G. duodenalis задейства активирането на нуклеотиди, свързващи вътреклетъчен олигомеризационен рецептор 3 (NLRP3) и регулира възпалителните реакции на гостоприемника чрез секреция на извънклетъчни везикули (EV).Въпреки това, точните молекулярни модели на свързания с патогена дуоденококов EV (GEV), участващ в този процес, и ролята на NLRP3 инфламазомата при лямблиоза остават да бъдат изяснени.
Рекомбинантни еукариотни експресионни плазмиди pcDNA3.1(+)-alpha-2 и alpha-7.3 giardins в GEV бяха конструирани, трансфектирани в миши първични перитонеални макрофаги и открити чрез измерване на възпалителната таргетна молекула каспаза-1.Беше скринирано нивото на експресия на р20..G. duodenalis alpha-2 и alpha-7.3 giardine първоначално бяха идентифицирани чрез измерване на NLRP3 инфламазома (NLRP3, про-интерлевкин-1 бета [IL-1β], про-каспаза-1 и каспаза-1 p20), секреция на IL.1β нива, нива на олигомеризация на апоптотичен петнист протеин (ASC) и имунофлуоресцентна локализация на NLRP3 и ASC.Ролята на NLRP3 инфламазомата в патогенността на G. duodenalis след това беше оценена с помощта на мишки, при които NLRP3 активирането беше блокирано (NLRP3 блокирани мишки) и бяха наблюдавани патологични промени в телесното тегло, дуоденалното паразитно натоварване и дуоденалната тъкан.В допълнение, ние изследвахме дали хиардините алфа-2 и алфа-7.3 индуцират секреция на IL-1β in vivo чрез NLRP3 инфламазома и определихме ролята на тези молекули в патогенността на G. duodenalis при мишки.
Алфа-2 и алфа-7.3 giardine индуцират активирането на NLRP3 инфламазома in vitro.Това доведе до активиране на р20 каспаза-1, повишаване на нивата на експресия на протеини NLRP3, pro-IL-1β и pro-caspase-1, значително повишаване на секрецията на IL-1β, образуване на ASA петна в цитоплазма и индуцирането на ASA олигомеризация.NLRP3 възпаление Загубата на пениса изостря патогенността на G. duodenalis при мишки.Мишки, третирани с кисти чрез сонда от NLRP3-блокирани мишки, показват повишен брой трофозоити и тежко увреждане на дуоденалните власинки, характеризиращи се с некротични крипти със свити и разклонени.In vivo експерименти показват, че giardines alpha-2 и alpha-7.3 могат да индуцират секреция на IL-1β чрез NLRP3 инфламазома, а имунизацията с giardines alpha-2 и alpha-7.3 намалява патогенността на G. duodenalis при мишки.
Взети заедно, резултатите от това проучване предполагат, че лямблиите алфа-2 и алфа-7.3 предизвикват регулиране на възпалението на гостоприемника NLRP3 и намаляват инфекциозността на G. duodenalis при мишки, които са обещаващи цели за предотвратяване на лямблиоза.
Giardia duodenum е извънклетъчен протозоен паразит, който живее в тънките черва и причинява 280 милиона случая на лямблиоза с диария годишно, особено сред малки деца в развиващите се страни [1].Хората се заразяват чрез пиене на вода или храна, замърсени с кисти на M. duodenum, които след това навлизат в стомаха и се отделят със стомашния сок.Giardia duodenum trophozoites се прикрепят към дуоденалния епител, причинявайки гадене, повръщане, диария, коремна болка и загуба на тегло.Индивидите с имунен дефицит и кистозна фиброза са податливи на инфекция.Заразяването може да стане и чрез орален и анален секс [2].Лекарства като метронидазол, тинидазол и нитазоксанид са предпочитаните възможности за лечение на дуоденални инфекции [3].Тези химиотерапевтични лекарства обаче причиняват нежелани странични ефекти като гадене, карциногенеза и генотоксичност [4].Следователно трябва да се разработят по-ефективни стратегии за предотвратяване на инфекция с G. duodenalis.
Инфламазомите са клас цитозолни протеинови комплекси, които са част от вродения имунен отговор, като помагат за защита срещу инвазия на патогени и медиират възпалителни реакции [5].Сред тези инфламазоми, нуклеотид-свързваща олигомеризация (NOD) рецептор 3 (NLRP3) нуклеотид-свързваща олигомеризация (NLRP3) нуклеотид-свързваща подобна инфламазома е широко проучена, тъй като може да бъде открита от различни патогенни/свързани с увреждане молекулярни модели (PAMP/ DAMP), разпознава, активира вродената имунна система.и регулира чревната хомеостаза при много възпалителни заболявания [6,7,8].Състои се от рецептор за разпознаване на образи (PRR) NLRP3, адаптерен апоптотичен петнист протеин (ASC) и ефекторна прокаспаза-1 или прокаспаза-11.Инфламазомата NLRP3 действа като гостоприемник срещу инвазията на патогени, както се наблюдава в изследванията на Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] и Leishmania.[11], но също така се съобщава, че активирането на NLRP3 инфламазома ограничава защитните имунни отговори и изостря прогресията на заболяването, например при червеи [12].Въз основа на нашите предишни констатации, ние докладвахме, че извънклетъчният G. duodenalis задейства вътреклетъчното активиране на NLRP3 възпаление и модулира възпалителните реакции на гостоприемника чрез секретиране на извънклетъчни везикули (EV) [13].Въпреки това, ролята на инфламазомата NLRP3 при инфекция с G. duodenalis in vivo остава да бъде определена.
Giardins първоначално са описани като структурни компоненти на цитоскелета на G. duodenalis и играят важна роля в подвижността на трофозоитите и прикрепването на епителните клетки в тънките черва.За да се адаптират по-добре към околната среда и да увеличат своята патогенност, трофозоитите на G. duodenalis развиват уникална цитоскелетна структура, състояща се от 8 флагела, 1 средно тяло и 1 вентрален диск [14].Трофозоитите на Giardia duodenum използват своя цитоскелет, за да проникнат в горната част на тънките черва, особено в дванадесетопръстника, и да се прикрепят към ентероцитите.Те постоянно мигрират и се прикрепят към епителните клетки, използвайки клетъчния метаболизъм.Следователно съществува тясна връзка между техния цитоскелет и вирулентност.Жиардините, специфични за Giardia duodenum, са компоненти на структурата на цитоскелета [15] и са разделени на четири класа: α-, β-, γ- и δ-giardines.Има 21 члена на семейството на α-giardin, всички от които имат калциево-зависима способност да свързват фосфолипиди [16].Те също така свързват цитоскелета с клетъчната мембрана.При индивиди с диария, причинена от G. duodenalis, α-гиардините са силно експресирани и имунореактивни по време на инфекция [17].Хетероложните ваксини, базирани на Giardia alfa-1, защитават срещу лямблиоза при мишки и са потенциални кандидат-антигени за разработване на ваксина [18].Алфа-8 giardin, локализиран в плазмената мембрана и жгутиците, но не и във вентралния диск, повишава подвижността и скоростта на растеж на трофозоитите в G. duodenalis [19].Алфа-14 giardin се прикрепя към микротубулни структури на камшичета и засяга жизнеспособността на G. duodenalis [20].Алфа-11 giardine присъства в изобилие през целия жизнен цикъл и свръхекспресията на alpha-11 giardine уврежда самия G. duodenalis [21].Въпреки това, не е ясно дали алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин са защитни срещу инфекция с G. duodenalis и техните основни механизми.
В това изследване, рекомбинантни еукариотни експресионни плазмиди pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine и pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine бяха трансфектирани в миши първични перитонеални макрофаги за активиране на гостоприемника NLRP3.След това инфламазомните цели бяха скринирани.Ние също така оценихме ролята на инфламазомата NLRP3 в патогенността на G. duodenalis, изследвахме дали алфа-2 и алфа-7,3 гиардините индуцират активиране на инфламазомата NLRP3 in vivo и установихме, че тези две роли на гиардините в патогенността на G. duodenalis.Нашата обща цел беше да разработим обещаващи цели за превенция на инфекция с G. duodenalis.
Див тип (WT) C57BL/6 женски мишки на възраст 5–8 седмици бяха закупени от Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Китай).Мишките имаха свободен достъп до вода, получиха стерилизирана храна и бяха държани в 12/12 часов цикъл светлина/тъмнина.Преди инфекцията мишките получават антибиотици ad libitum в питейна вода, допълнена с ампицилин (1 mg/mL), ванкомицин (1 mg/mL) и неомицин (1,4 mg/mL) (всички закупени от Шанхай, Китай, изкуствени организми) [ 22 ].].Мишки, които са загубили способността да ядат и пият за > 24 часа и са загубили ≥ 20% телесно тегло, са хуманно евтаназирани чрез цервикална дислокация.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) бяха допълнени с 12,5% фетален волски серум (FBS; Every Green, Zhejiang, Китай) и 0,1% волска жлъчка (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) ).САЩ) при микроаеробни условия.Сливащи се трофозоити се събират върху лед и се пасират в съотношение 1:4 за по-нататъшно възпроизвеждане.
Кистите на Giardia duodenum бяха индуцирани, както е описано по-рано [23], трофозоитите бяха събрани в логаритмична фаза и след това разредени със среда, предизвикваща капсулиране, рН 7.1 (модифициран TYI-S-33) до крайна концентрация от 1 × 106 трофозоити/mL.концентрация на жлъчка 0,05% среда).Трофозоитите се култивират при анаеробни условия при 37°C до фазата на логаритмичен растеж.Променете средата на среда, предизвикваща цисти (pH 7,8; ​​модифицирана среда TYI-S-33 с 1% концентрация на жлъчка) и култивирайте G. duodenalis при 37°C за 48–96 часа, по време на които образуваните кисти се наблюдават под микроскоп.След като повечето от трофозоитите бяха индуцирани да образуват кисти, културалната смес беше събрана и ресуспендирана в стерилна дейонизирана вода, за да се лизират останалите трофозоити.Кистите се преброяват и съхраняват при 4°C за последващи анализи през стомашна сонда при мишки.
Извънклетъчните везикули на Giardia (GEV) бяха обогатени, както е описано по-рано [13].Трофозоитите в логаритмична фаза на растеж бяха ресуспендирани в модифицирана среда TYI-S-33, приготвена с FBS с изчерпани екзозоми (Biological Industries, Beit-Haemek, Израел) до крайна концентрация от 1 × 106 паразити/mL и инкубирани за 12 часа.се изолират от супернатанта на културата чрез центрофугиране при 2000 g за 10 минути, 10 000 g за 45 минути и 100 000 g за 60 минути.Преципитатите се разтварят във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), определят се количествено с помощта на комплект за анализ на протеин BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и се съхраняват при -80°С или се използват директно за допълнителни анализи.
Първичните миши перитонеални макрофаги се приготвят, както е описано по-рано [24].Накратко, мишки (на възраст 6-8 седмици) бяха инжектирани (интраперитонеално [ip]) с 2.5 ml от 2.98% Difco течна тиогликолова среда (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) и хранени с 3-4 небца.Суспензия от макрофаги се събира от коремната кухина на мишки след евтаназия и се центрофугира 3 пъти при 1000 g за 10 минути.Събраните клетки се откриват чрез поточна цитометрия, като се използва CD11b маркер, докато клетъчната чистота стане >98%, след което се добавят към плочи с 6-ямкови клетъчни култури (4,5 х 106 клетки/ямка) и се инкубират с 10% FBS (Bioindustry) при 37°C.и 5% CO2.
РНК се екстрахира от 1 × 107 трофозоити в 1 ml TRIzol реагент (Vazyme, Nanjing, Китай), геномна ДНК се екстрахира от общата G. duodenalis РНК с помощта на MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Китай) и се синтезира комплементарна ДНК (cDNA). използвайки MonScript RTIIII Super Mix (Monad) според инструкциите на производителя.
Информация за CDS последователността за целевия ген на G. duodenalis беше получена от NCBI GenBank.Използвайте Primer 5.0, за да проектирате специфични безпроблемни праймери за клониране за всеки целеви ген.Предният праймер (5′-3′) се състои от три части: припокриваща се последователност с линеаризиран вектор pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) и начални кодони ATG и GNN (ако първата база не е G).Това се прави, за да се подобри ефективността на израза.В допълнение, най-малко 16 bp комбинирани бази (GC съдържание 40–60%/Tm приблизително 55 °C).Обратният праймер (5'-3') се състои от две части, припокриваща се последователност с EcoRV-линеаризиран вектор pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) и комбинирана база от най-малко 16 bp.(без последните две спирки).бази) кодон като AA или GA, за да позволи на рекомбинантните плазмиди да експресират своите белязани протеини).Праймерните последователности са изброени в Таблица 1 и са синтезирани от Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Китай).
Целите бяха амплифицирани с помощта на Pfu ДНК полимераза (Tiangen, Пекин, Китай) или Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Пекин, Китай), използвайки подготвена сДНК на G. duodenalis като шаблон.Еукариотният експресионен векторен плазмид pcDNA3.1(+) беше линеаризиран с рестрикционен ензим EcoRV и дефосфорилиран с помощта на Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Линеаризирани pcDNA3.1(+) фрагменти и амплифицирани целеви генни фрагменти бяха пречистени с помощта на комплект за пречистване на ДНК гел (Tiangen) и количествено определени с помощта на Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Фрагментът pcDNA3.1(+) и всеки целеви генен фрагмент бяха рекомбинирани с помощта на смес за клониране на едно сглобяване MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Суджоу, Китай) и потвърдени чрез ДНК секвениране с помощта на Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Китай)..
Плазмидите без ендотоксини pcDNA3.1(+)-alpha-2 и pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 бяха генерирани с помощта на SanPrep Mini Kit без ендотоксини Plasmid (Sangon Biotech).Концентрацията се поддържа над 500 ng/µl, за да се гарантира, че EDTA в елуиращия буфер не пречи на анализа на трансфекцията.Първичните миши перитонеални макрофаги се култивират в 6-ямкови плаки с пълна среда RPMI 1640 (Biological Industries) в продължение на 12 часа, след това клетките се промиват 3 пъти в топъл PBS за отстраняване на пеницилин и стрептомицин и след това в среда, допълнена с пълна среда.Плазмидите без ендотоксин pcDNA3.1(+)-alpha-2 и pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) се разреждат в 125 μl Opti-MEM редуцирана серумна среда (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..След това 5 ul от трансфекционния реагент Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) се разреждат в 125 ul ниско серумна Opti-MEM среда.Пригответе липозомно-ДНК комплекси чрез смесване на разредения свободен от ендотоксин плазмид с Lipofectamine 2000 и оставяне на сместа да престои на стайна температура за 5 минути.Прехвърлете комплексите отделно в клетките във всяка ямка и разбъркайте бавно.След 4 часа средата на клетъчната култура се заменя с 2 ml пълна среда RPMI 1640 и културата продължава 24 часа.Прясна среда за клетъчна култура се добавя към клетките и се инкубира за различни времеви точки в зависимост от дизайна на анализа.
Протеинови проби от супернатанти и клетъчни лизати се приготвят, както е описано по-горе [25].Параметрите на мембранен трансфер за про-IL-1β, про-каспаза-1, каспаза-1 p20, NLRP3, β-актин и His-tag бяха 200 mA/90 минути.За интерлевкин 1β (IL-1β; R&D Systems, Минеаполис, Минесота, САЩ), каспаза-1 (p20) (Adipogen, Швейцария) и NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Швейцария) и 1:5000, насочен към His tag (Amylet Scientific, Ухан, Китай) и β-актин (Proteintech, Ухан, Китай).
Омрежването с дисукцинимид суберат (DSS) се извършва, както е описано по-рано [26].Клетките се промиват 3 пъти със студен PBS и се лизират напълно с игла 27 калибър в 50 ul ASC реакционен буфер (рН 8.0), съдържащ 25 mM Na2P04, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES и 125 mM NaHC03.Сместа се центрофугира при 5000 g за 3 минути и пелетата се зашива с 10 ul DSS (25 mM в DMSO) и 40 ul ASC реакционен буфер за 30 минути при 37°С.След центрофугиране при 5000 g за 10 минути, пелетата се разтваря в разтвор от 40 µl ASC реакционен буфер и 10 µl 6x буфер за зареждане с протеин (TransGen, Пекин, Китай) и след това разтворът се охлажда при стайна температура за 15 мин., След това се вари 10 минути.След това протеиновите проби се подлагат на Western blotting, като се използват първични анти-ASC антитела (Wanleibio, Shenyang, Китай) при съотношение на разреждане 1:500.
След описана по-рано процедура [13], супернатантите от клетъчни култури бяха събрани и секрецията на провъзпалителния цитокин IL-1β беше определена с помощта на миши IL-1 Beta ELISA комплект (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Преобразувайте стойностите на OD450nm в протеинови концентрации, като използвате стандартната крива на IL-1β.
Клетките, покрити върху покривни стъкла, бяха внимателно промити 3 пъти в топъл PBS, фиксирани във фиксатор на тъканни клетки (Biosharp, Пекин, Китай) за 10 минути при стайна температура (RT), в 0,1% Triton X-Permeabilize при 100 (разреден в PBS; Biosharp ) за 20 минути при стайна температура и блокирайте в 5% говежди серумен албумин (в PBS) за 2 часа при стайна температура.След това клетките се инкубират за една нощ при 4°C с първични антитела срещу ASC (1:100 разреждане) или NLRP3 (1:100 разреждане), съответно, и Cy3 белязан кози анти-заешки IgG(H+L) (1:400; EarthOx , Сан Франциско, Калифорния, САЩ) или FITC-конюгиран кози анти-миши IgG (1:400; Earthox) за една нощ при 37°C на тъмно за 1 час.Ядрата се оцветяват с Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Суджоу, Китай) в продължение на 5 минути и се наблюдават под флуоресцентен микроскоп (Olympus Corporation, Токио, Япония).
Мишките бяха разделени на четири групи (n = 7 във всяка група): (i) PBS-третирана отрицателна контролна група (само PBS; сонда 100 ul/мишка PBS, последвана от ежедневно интраперитонеално инжектиране на 100 ul/мишка PBS 3 часа по-късно)., непрекъснато в продължение на 7 дни);(ii) отрицателна контролна група, лекувана с MCC950 инхибитор [27] (100 µl/мишка чрез PBS сонда, 3 часа по-късно, 10 mg/kg телесно тегло [BW] MCC950 [в PBS] се прилага интраперитонеално дневно, продължителност 7 дни);(iii) Група на инфекция с киста G. duodenalis (1,5 х 106 кисти/мишка чрез сонда, 3 часа по-късно, 100 μl/мишка PBS интраперитонеално прилаган ежедневно в продължение на 7 дни);(iv) G. duodenalis киста комбинирана инфекция група MCC950 инхибиторна група на лечение (1,5 × 106 кисти/мишка чрез сонда, 10 mg/kg телесно тегло MCC950 интраперитонеално дневно в продължение на 7 дни на 3 часа).Телесното тегло на всяка мишка се наблюдава ежедневно и всички мишки се евтаназират на 7-ия ден.Събраният дуоденум (3 cm дълъг) се нарязва на малки парченца в 1 ml PBS, кистите се унищожават за една нощ в PBS при 4°C и G. duodenalis трофозоити.Свеж дуоденум (дълъг 1 cm) се изолира за оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E).
Мишките бяха разделени на две групи: (i) MOCK контролна група и (ii) MCC950 инхибиторна група.Във всяка група имаше пет лечения (n = 7/група за лечение): (i) PBS лечение с отрицателна контролна група (само PBS; 100 µl/мишка PBS, интрамускулна (IM) инжекция (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) плазмидна отрицателна контролна група (100 µg/мишка ДНК, чрез интрамускулна инжекция) (iii) G. duodenalis киста инфекция положителна контролна група (1,5 х 106 кисти/мишка, чрез сонда) (iv) a); група, третирана с плазмид pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 µg/мишка ДНК, чрез интрамускулна инжекция), и (v) група, третирана с плазмид pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/мишка ДНК, след 12 часа пасаж, мишките в групата с MCC950 инхибитор получават ежедневно интраперитонеално инжектиране на MCC950 (10 mg/kg телесно тегло) в продължение на 7 дни, докато мишките в MOCK групата получават равен обем лечение с PBS. Кръвните проби бяха събрани от очните ябълки на мишки и оставени за една нощ при 4 °C Серумни проби бяха изолирани с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) за и измервания на нивата на IL-1β.
Тридесет и пет мишки бяха разделени на пет групи (n=7/група).Група 1 беше отрицателна контролна група, лекувана с PBS: мишките получиха 100 μl PBS интрамускулно и 3 дни по-късно чрез сонда.Група 2 е положителна контролна група, заразена с кисти на G. duodenalis: мишките бяха инжектирани със 100 μl PBS и 3 дни по-късно 1,5 х 106 кисти/мишка бяха инжектирани интрагастрално.Трета група – плазмидна имунизация с pcDNA3.1(+) в комбинация с контролна група за инфекция с дуоденална киста: мишките получават 100 μg плазмидна ДНК pcDNA3.1(+)(im) перорално, 1,5×106 кисти/мишка 3 за няколко пъти дни.Групи 4 и 5 бяха рекомбинантен pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine плазмид или pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine плазмид в комбинация с инфекция с киста на G. duodenalis.Експериментална група: мишки получиха 100 µg pcDNA3.1(+)-giardine плазмидна ДНК (im), след това 3 дни по-късно, 1.5 × 106 кисти/мишка се инжектират чрез сонда.Телесното тегло на всяка мишка се наблюдава след въвеждането на киста G. duodenalis през тръбата.Свежият дванадесетопръстник беше събран за измерване на паразитно натоварване и анализ на оцветяване с HE.
Хистопатологичните промени бяха анализирани съгласно предварително публикувана процедура [30].Свежият дванадесетопръстник се фиксира с фиксатор на тъканни клетки, вграден в парафин, нарязан на 4 μm срезове, оцветен с H&E и анализиран под светлинен микроскоп.Представителни патологични промени в седем тъканни среза от седем независими мишки бяха оценени от патолог, който не е запознат с лечението, и бяха заснети при 200x увеличение.Дължината на вилите и дълбочината на криптите бяха измерени в съответствие с описаните по-горе методи.
Резултатите in vitro и in vivo са получени в три екземпляра.Графиките бяха генерирани с помощта на GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, Калифорния, САЩ).Разликите между две групи бяха анализирани чрез t-тест, докато разликите между ≥3 групи бяха анализирани чрез еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) с помощта на софтуер SPSS (версия 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Данните бяха анализирани за хомогенност на дисперсията с помощта на теста на Levene, последван от post hoc теста на Bonferroni (B).Значимостта се изразява като P<0,05, P<0,01 и P<0,001 (незначително [ns]) (P>0,05).
Нашият предишен анализ на протеомиката на GEV в Енциклопедията на гените и геномите на Киото (KEGG) показа, че много цели могат да бъдат включени в активирането на възпалителни сигнални пътища [13].Ние избрахме две обещаващи мишени, алфа-2 и алфа-7.3 гиардини, усилваме тези молекули и ги използваме за конструиране на pcDNA3.1(+) еукариотния експресионен вектор.След секвениране, рекомбинантни pcDNA3.1(+)-alpha-2 и alpha-7.3 giardine експресионни плазмиди бяха трансфектирани в първични миши перитонеални макрофаги и бе идентифициран белтъкът на каспаза-1 p20 на възпалението (фрагмент от активирана каспаза-1). като изясняване на ключови молекули, които могат да предизвикат възпаление.Резултатите показват, че алфа-2 и алфа-7.3 гиардините могат да индуцират р20 експресия на каспаза-1, подобна на GEV.Не е открит ефект върху активирането на каспаза-1 в нетретираната отрицателна контрола (само PBS) и плазмидната контрола pcDNA3.1(+) (Фигура 1).
Измерване на активирането на р20 каспаза-1 чрез pcDNA3.1(+)-алфа-2 и алфа-7.3 гиардини.Рекомбинантни еукариотни експресионни плазмиди pcDNA3.1(+)-alpha-2 и alpha-7.3 giardine (над всяка лента) бяха трансфектирани в първични миши перитонеални макрофаги и супернатантите от културата бяха събрани 24 часа по-късно.Western blotting се използва за измерване на нивата на експресия на сигнатурата на каспаза-1 р20 възпалителния протеин.Групата на лечение само с PBS (лента C) и групата на монотерапия с pcDNA3.1(+) (лента pcDNA3.1) бяха използвани като отрицателна контрола, а групата на лечение с GEV беше използвана като положителна контрола.Експресията на рекомбинантния протеин се потвърждава чрез откриване на хистидинов маркер във всеки протеин и очакваните протеинови ленти са алфа-2 гиардин (38.2 kDa) и алфа-7.3 гиардин (37.2 kDa).GEV, извънклетъчни везикули на Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), EcoRV-линеаризиран вектор, SUP, супернатант
За да се определи дали алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин индуцират р20 експресия на каспаза-1 и играят роля в активирането на NLRP3 възпалителния отговор на гостоприемника, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine и pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin се трансфектира в първични миши перитонеални макрофаги с рекомбинантна плазмидна ДНК и се определят нивата на експресия, локализация и олигомеризация на ключовите възпалителни протеини NLRP3.В този експеримент GEV беше използван като положителна контролна група, а групата без лечение (само PBS) или групата на лечение с pcDNA3.1(+) трансфекция беше отрицателната група.Резултатите показват, че както в GEV групата, рекомбинантната плазмидна ДНК на giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 и giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 води до регулиране нагоре на NLRP3, pro-IL-1β и прокаспаза-1 и активиране на каспаза-1 (фиг. 2а).В допълнение, и двата giardine индуцират значителна секреция на IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; алфа-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;алфа-7.3 гиардин: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Фигура 2b).Повечето ASC протеини са мономерни в групата без лечение или в групата на лечение, трансфектирани с pcDNA3.1(+) плазмид, за разлика от pcDNA3.1(+)-alpha-2 или pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 гиардини.ASC олигомеризация настъпва в рекомбинантната плазмидна ДНК на GEV положителна контролна група или група, показваща олигомерна форма (Фигура 2с).Тези предварителни данни предполагат, че алфа-2 гиардин и алфа-7,3 гиардин могат да индуцират активиране на възпаление на NLRP3.Последващите имунофлуоресцентни изследвания на локализацията на ASC и NLRP3 показват, че в групата с отрицателна контрола ASC протеинът е разпръснат в цитоплазмата и се появява като точков сигнал при стимулиране на pcDNA3.1(+)-alpha-2 с giardine или pcDNA3.1(+)-алфа-7,3 гиардинова група или GEV положителна контролна група (Фигура 2d).В групите с отрицателна контрола и третирани с плазмид pcDNA 3.1, NLRP3 протеиновият сигнал не беше открит, докато флуоресцентна сигнална точка в отговор на pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine или pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 беше открит..giardine се откриват в цитоплазмата или при стимулация на HEV (фиг. 2е).Тези данни допълнително демонстрират, че G. duodenalis giardin alpha-2 и giardin alpha-7.3 активират NLRP3 инфламазомата в миши първични перитонеални макрофаги.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin и pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin активират инфламазомата NLRP3 в миши перитонеални макрофаги.Трансфектирайте рекомбинантните еукариотни експресионни плазмиди pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin и pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin в първични миши перитонеални макрофаги и клетки или съберете супернатантата в рамките на 24 часа за анализ на експресията, олигомеризация , секреция.и локализиране на ключови възпалителни протеини.Групата само с PBS (C) и групата с единично лечение с pcDNA3.1(+) бяха използвани като отрицателна контрола, а групата с GEV лечение беше използвана като положителна група.a Ключови възпалителни протеини NLRP3, включително NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 и p20 caspase-1, бяха открити чрез Western blotting.b Нивата на секреция на IL-1β в супернатантите се определят с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA).Разликите между контролните и експерименталните групи бяха анализирани чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) с помощта на SPSS софтуер версия 22.0.Звездичките показват значителни разлики между групите **P<0.01 и ***P<0.001.c Нивата на олигомеризация на ASC в пелети се определят чрез DSS анализ на омрежване, докато нивата на ASC в клетъчни лизати се използват като контрола на натоварването.d Визуализация на локализацията на ISC с помощта на имунофлуоресценция.e Имунофлуоресценцията беше използвана за визуализиране на локализацията на NLRP3.ASC, апоптотичен протеин, подобен на петна;IL, интерлевкин;NLRP3, нуклеотид-свързващ олигомеризационен подобен рецептор 3;ns, незначително (P > 0,05)
Както G. duodenalis, така и GEVs, които той секретира, активират инфламазомата NLRP3 и регулират възпалителните реакции на гостоприемника in vitro.По този начин ролята на инфламазомата NLRP3 в патогенността на G. duodenalis остава неясна.За да проучим този проблем, ние проектирахме експеримент между мишки, заразени с киста на G. duodenalis и мишки, заразени с киста на G. duodenalis + лечение с инхибитор на MCC950 и сравнихме експресията на инфламазома на NLRP3, когато са заразени с киста на G. duodenalis.Подробна схема на експеримента е показана на фиг. 3а.Промените в телесното тегло на мишки в различни третирани групи се наблюдават в продължение на 7 дни след заразяване с кисти и резултатите са показани на Фиг. 3b.В сравнение с групата, лекувана с чист PBS, резултатите показват, че (i) телесното тегло на мишки, заразени с G. duodenalis киста, намалява от ден 3 до ден 7 след инфекцията;(ii) лечението с инхибитора MCC950 няма значителен ефект върху телесното тегло на мишките..В сравнение с групата с единична инфекция, телесното тегло на групата с дуоденална инфекция, лекувана с MCC950, намалява в различна степен (Ден 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Ден 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; Ден 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; Ден 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; Ден 5: ANOVA, F (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; Ден 6: ANOVA, F(3, 24) = 5,457, P = 0,0175; Ден 7: ANOVA, F (3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Тези данни показват, че инфламазомата NLRP3 предпазва мишките от значителна загуба на тегло в ранните етапи (2-4 дни) на дуоденална инфекция.След това имахме за цел да открием трофозоити на G. duodenalis в промивна течност на дванадесетопръстника и резултатите са показани на Фигура 3с.В сравнение с групата с инфекция с киста G. duodenalis, броят на трофозоитите в дванадесетопръстника значително се увеличава след блокиране на инфламазомата NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Тъканите на дванадесетопръстника, оцветени с HE, показват в сравнение с отрицателната контрола, лекувана само с PBS и MCC950: ​​(i) инфекция с киста G. duodenalis е довела до увреждане на дуоденалните въси (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P= 0.0488 ) и атрофия на криптата (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) дванадесетопръстник от мишки, заразени с кисти на G. duodenalis и третирани с MCC950 инхибитори.дуоденалните вили бяха увредени и мъртви (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) с атрофия и разклоняване на криптата (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Фиг. 3d- е) .Тези резултати предполагат, че инфламазомата NLRP3 играе роля в намаляването на патогенността на G. duodenalis.
Роля на NLRP3 инфламазома при инфекция на Giardia duodenum.Мишките бяха третирани със сонда (iv) с дуоденококови кисти и след това третирани с или без MCC950 (ip).Единични групи за лечение с PBS или MCC950 бяха използвани като контроли.Експериментална група и режим на лечение.b Телесното тегло на мишките във всяка от различните групи за лечение се наблюдава в продължение на 7 дни.Разликата между групата на инфекция с G. duodenalis и групата на лечение с инфекция с G. duodenalis + MCC950 беше анализирана чрез t-тест с помощта на SPSS софтуер версия 22.0.Звездичките показват значителни разлики при *P<0,05, **P<0,01 или ***P<0,001.c Паразитното натоварване се определя чрез преброяване на броя на трофозоитите в промивната течност на дванадесетопръстника.Разликата между групата на инфекция с G. duodenalis и групата на лечение с инфекция с G. duodenalis + MCC950 беше анализирана чрез t-тест с помощта на SPSS софтуер версия 22.0.Звездичките показват значителни разлики при *P <0,05.d Резултати от оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) от дуоденална хистопатология.Червените стрелки показват увреждане на вилите, зелените стрелки показват увреждане на криптите.Скала: 100 µm.e, f Статистически анализ на височината на дуоденалния вил и височината на криптата на мишката.Звездичките показват значителни разлики при *P<0,05 и **P<0,01.Резултатите са взети от 7 независими биологични експеримента.BW, телесно тегло;ig, интрагастрален път на доставяне;ip, интраперитонеален път на доставяне;ns, незначително (P > 0,05);PBS, фосфатно буфериран физиологичен разтвор;WT, див тип
Секрецията на IL-1β е отличителен белег на активирането на възпалението.За да се определи дали G. duodenalis алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин активират NLRP3 гостоприемника инфламазома in vivo, ние използвахме нелекувани WT мишки (фалшива група) и NLRP3 инфламазома-блокирани мишки (MCC950 инхибирана група за лечение).Подробна схема на експеримента е показана на фиг. 4а.Експерименталните групи се състоят от мишки, третирани с PBS, лечение на киста на G. duodenalis чрез сонда, интрамускулно инжектиране на pcDNA3.1 и интрамускулно инжектиране на pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine или pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.На 7-ия ден след интрамускулно приложение на рекомбинантния плазмид се събира серум и се определя нивото на IL-1β във всяка група.Както е показано на Фигура 4b, в MOCK групата: (i) в сравнение с PBS групата, лечението с pcDNA3.1 няма значим ефект върху секрецията на IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), обаче, Секрецията на IL-β е значително повишена в групата с киста G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine и pcDNA3.1- Интрамускулно инжектиране на алфа-7.3 гиардин значително повишава серумните нива на IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine индуцира високи нива на IL-1β секреция в групата на интрамускулно инжектиране на pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .В сравнение с всяка група в групата на лечение с MCC950 и групата на MOCK: (i) нивата на секреция на IL-1β в контролната група на PBS и контролната група на pcDNA3.1 намаляват до известна степен след блокиране на инхибитора MCC950, но разликата не е значимо (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) след блокиране на MCC950., секрецията на IL-1β е значително намалена в групата, заразена с киста на G. duodenalis, групата с pcDNA3.1-alpha-2 giardine и групата с pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3.540, P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(9, 58) ) = 3,540, Р = 0,0164).Тези резултати предполагат, че алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин медиират активирането на инфламазомата NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines активира NLRP3 гостоприемника inflammasome in vivo.Мишките бяха имунизирани (IM) с рекомбинантен еукариотен експресионен плазмид pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine или pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine и след това третирани с MCC950 (ip; група MCC950) или не (фалшива група) ).Групата за лечение с PBS или pcDNA3.1(+) плазмид се използва като отрицателна контрола, групата за лечение с киста G. duodenalis се използва като положителна контрола.Експериментална група и режим на лечение.b Серумните нива на IL-1β при мишки бяха измерени на ден 7 чрез ELISA анализ.Разликите между групите в групата MOCK бяха анализирани с помощта на еднопосочен ANOVA, а разликите между групата MOCK и групата MCC950 бяха анализирани с помощта на t-тест на SPSS софтуер версия 22.0.Звездичките показват значителни разлики между групите на лечение в MOCK групата, *P<0,05 и ***P<0,001;знаците за долар ($) показват значителни разлики между всяка група в групата MOCK и групата MCC950 при P<0.05.Резултати от седем независими биологични експеримента.i, интрамускулна инжекция, ns, незначително (P > 0,05)
За да изследваме ефекта от алфа-2 и алфа-7.3 гиардин-медиирано активиране на NLRP3 гостоприемника inflammasome върху инфекциозността на G. duodenalis, ние използвахме WT C57BL/6 мишки и инжектирахме алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин.плазмидът се инжектира интрамускулно след 3 дни през стомашната тръба на кистата на G. duodenalis, след което мишките се наблюдават в продължение на 7 дни.Подробна схема на експеримента е показана на фиг. 5а.Телесното тегло на всяка мишка се измерва всеки ден, проби от свежа дуоденална тъкан се събират на 7-ия ден след прилагане през стомашна сонда, броят на трофозоитите се измерва и се наблюдават хистопатологични промени.Както е показано на Фигура 5b, с увеличаване на времето за хранене, BW на мишки във всяка група постепенно се увеличава.MT на мишки започва да намалява на 3-ия ден след интрагастрално приложение на кисти на G. duodenalis и след това постепенно се повишава.Активирането на инфламазомата NLRP3, индуцирано от интрамускулно инжектиране на алфа-2 гиардин и алфа7.3 гиардин значително намалява загубата на тегло при мишки (Ден 1: pcDNA3.1-алфа-2 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0.9754 Ден 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Ден 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Ден 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; Ден 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Ден 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083; Ден 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Ден 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, Ден 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Ден 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Ден 6: pcDNA3 .1 - алфа-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Ден 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Ден 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Ден 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Паразитното натоварване беше оценено в дванадесетопръстника (фиг. 5в).В сравнение с нетретираната положителна контрола и групата, инжектирана с празен pcDNA3.1 вектор, броят на G. duodenalis трофозоити е значително намален в групите, инжектирани с α-2 гиардин и α-7,3 гиардин (pcDNA3.1-alpha -2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).В допълнение, giardine alfa-7.3 е по-защитен при мишки, отколкото giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Резултатите от HE оцветяването са показани на фиг.5d–f.Мишки, инжектирани с алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин, имат по-малко лезии на дуоденалната тъкан, проявени чрез увреждане на вилуса, в сравнение с мишки, инжектирани с G. duodenalis и мишки, инжектирани с G. duodenalis в комбинация с празен pcDNA3 вектор .1 Увеличение.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 или P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 или P = 0,0055) и намалена атрофия на криптите (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 или P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 или P = 0,0191).Тези резултати предполагат, че алфа-2 гиардин и алфа-7,3 гиардин намаляват инфекциозността на G. duodenalis чрез активиране на инфламазомата NLRP3 in vivo.
Роля на pcDNA3.1(+)-giardins при инфекция с G. duodenalis.Мишките бяха имунизирани (IM) с рекомбинантни еукариотни експресионни плазмиди pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine или pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine и след това заразени с G. duodenalis cysts (ig).PBS групата и групата за лечение на pcDNA3.1(+) + дуоденална киста бяха използвани като отрицателни контролни групи, а групата за лечение на дуоденална киста беше използвана като положителна контролна група.Експериментална група и режим на лечение.b MT на мишки във всяка от различните групи за лечение се наблюдава в продължение на 7 дни след заразяването.Звездичките показват значителни разлики между групите в групата на G. duodenalis и групата на pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P <0.05, **P <0.01 и ***P <0.001;знакът за долар ($) показва значителна разлика между всяка група от G. duodenalis и групата на pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0.01 и $$$P<0.001.c Паразитното натоварване се определя чрез преброяване на броя на трофозоитите в 1 ml дуоденален лаваж от дванадесетопръстника (3 cm дължина) и се изразява като брой паразити на cm дуоденум.Разликите между групата с инфекция с G. duodenalis, групата с pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine и групата с pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA с помощта на SPSS софтуер версия 22.0.Звездичките показват значителни разлики при **P<0,01 и ***P<0,001.d Хистопатологични промени в дуоденума.Червените стрелки показват увреждане на вилите, зелените стрелки показват увреждане на криптите.Скала: 100 µm.e, f Статистически анализ на височината на дванадесетопръстника на мишка (e) и височината на криптата (f).Разликите между групите на Фигура 1d бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA с помощта на SPSS софтуер версия 22.0.Звездичките показват значителни разлики при *P<0,05 и **P<0,01.Резултати от седем независими биологични експеримента.ns, незначително (P > 0,05)
Giardia duodenum е добре известен чревен паразит при хора и други бозайници, който причинява лямблиоза.През 2004 г. той беше включен в Инициативата за пренебрегвани заболявания на СЗО поради високото си разпространение в продължение на 6 години, особено в общности с нисък социално-икономически статус [32].Вродената имунна система играе критична роля в имунния отговор на инфекция с G. duodenalis.Съобщава се, че миши макрофаги поглъщат и убиват G. duodenalis чрез освобождаване на извънклетъчни капани [33].Нашите предишни проучвания показват, че G. duodenalis, неинвазивен извънклетъчен паразит, активира p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 и NLRP3 възпалителни сигнални пътища в миши макрофаги за регулиране на възпалителните реакции на гостоприемника и освободеният GEV може да подобри този процес.13], 24].Въпреки това, точните PAMPs, участващи в NLRP3 инфламазома-регулирано възпаление в GEV и ролята на NLRP3 инфламазома в ламблиозата остават да бъдат изяснени.За да хвърлим светлина върху тези два въпроса, проведохме това проучване.
Инфламазомата NLRP3 се намира в цитоплазмата на имунните клетки и може да се активира от различни частици като кристали на пикочна киселина, токсини, бактерии, вируси и паразити.В бактериални проучвания токсините са идентифицирани като ключови PAMPs, които активират възпалителни сензори, водещи до възпаление и клетъчна смърт [34].Някои структурно различни токсини, като хемолизин от Staphylococcus aureus [35] и Escherichia coli [36], хемолизин BL (HBL) от ентеротоксин (NHE) [37], индуцират активирането на NLRP3 възпаление.Вирусни изследвания показват, че протеини на вирулентност като SARS-COV-2 обвивка (E) протеин [38] и протеин NS5 на вируса Zika [39] са важни PAMPs, разпознати от NLRP3 рецептора.При изследвания на паразити се съобщава, че много паразити са свързани с активиране на инфламазома на гостоприемника, като Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] и Leishmania [42].Протеините с плътни гранули GRA35, GRA42 и GRA43, свързани с вирулентността на Toxoplasma gondii, са необходими за индуцирането на пироптоза в макрофагите на плъх Lewis [43].В допълнение, някои проучвания на Leishmania са фокусирани върху отделни молекули, участващи в инфламазомата NLRP3, като липофосфогликан на паразитната мембрана [44] или цинкова металопротеаза [45].Сред анексин-подобното семейство от гени на алфа-giardin, alpha-1 giardin е доказано, че е потенциален кандидат за ваксина, осигуряващ защита срещу G. duodenalis в миши модел [18].В нашето проучване ние избрахме фактори на вирулентност на G. duodenalis алфа-2 и алфа-7,3 giardine, които са уникални за лямблиите, но сравнително по-малко докладвани.Тези два целеви гена бяха клонирани в pcDNA3.1(+) вектора на еукариотната експресионна система за анализ на активирането на възпалението.
В нашия модел на мишка, разцепените фрагменти на каспаза служат като маркери на възпалителна активация.При стимулация NLRP3 взаимодейства с ASC, набира прокаспази и генерира активни каспази, които разцепват про-IL-1β и pro-IL-18 в зрял IL-1β и IL-18, съответно -18.Възпалителните каспази (каспази-1, -4, -5 и -11) са запазено семейство от цистеинови протеази, които са критични за вродената защита и участват във възпаление и програмирана клетъчна смърт [46].Каспаза-1 се активира от канонични инфламазоми [47], докато каспази-4, -5 и -11 се разцепват по време на образуването на атипични инфламазоми [48].В това проучване използвахме миши перитонеални макрофаги като модел и изследвахме р20 каспаза-1 разцепена каспаза-1 като маркер за активиране на възпалението на гостоприемника NLRP3 в проучвания на инфекция с G. duodenalis.Резултатите показват, че много алфа-гиардини са отговорни за типичното активиране на възпалението, което е в съответствие с откриването на ключови вирулентни молекули, включени в бактериите и вирусите.Въпреки това, нашето изследване е само предварителен скрининг и има други молекули, които могат да активират некласическите инфламазоми, тъй като предишното ни проучване откри както класически, така и некласически инфламазоми при инфекция с G. duodenalis [13].За по-нататъшно определяне дали генерираната p20 каспаза-1 е свързана с NLRP3 инфламазомата, ние трансфектирахме алфа-2 и алфа-7.3 гиардини в миши перитонеални макрофаги, за да определим нивата на експресия на ключови молекулни протеини и нивата на олигомеризация на ASC, потвърждавайки, че и двата α-гиардини активират възпалителна NLRP3.Нашите резултати са малко по-различни от тези на Manko-Prykhoda et al., които съобщават, че стимулирането на Caco-2 клетки само с G. muris или E. coli EPEC щамове може да увеличи интензитета на флуоресценция на NLRP3, ASC и каспаза-1, макар и не значително, докато костимулацията на G. muris и E. coli повишава нивата на три протеина [49].Това несъответствие може да се дължи на разлики в селекцията на видове Giardia, клетъчни линии и първични клетки.Ние също така извършихме in vivo анализи, използвайки MCC950 в 5-седмични женски WT C57BL/6 мишки, които са по-податливи на G. duodenalis.MCC950 е мощен и селективен инхибитор на NLRP3 с малка молекула, който блокира канонично и неканонично активиране на NLRP3 при наномоларни концентрации.MCC950 инхибира активирането на NLRP3, но не повлиява активирането на AIM2, NLRC4 и NLRP1 възпалителни пътища или TLR сигнални пътища [27].MCC950 блокира активирането на NLRP3, но не инхибира инициирането на NLRP3, ефлукса на K+, притока на Ca2+ или взаимодействието между NLRP3 и ASC;вместо това, той инхибира активирането на NLRP3 инфламазома чрез блокиране на ASC олигомеризацията [27].Затова използвахме MCC950 в in vivo проучване, за да определим ролята на NLRP3 инфламазома след инжектиране на giardine.Активираната каспаза-1 p10 разцепва провъзпалителните цитокини pro-IL-1β и pro-IL-18 в зрели IL-1β и IL-18 [50].В това проучване серумните нива на IL-1β при мишки, третирани с giardine със или без MCC950, са използвани като индикатор за това дали NLRP3 инфламазомата е активирана.Както се очаква, лечението с MCC950 значително намалява серумните нива на IL-1β.Тези данни ясно демонстрират, че G. duodenalis giardin alfa-2 и giardin alfa-7.3 са в състояние да активират NLRP3 миша инфламазома.
Значителни данни, натрупани през последното десетилетие, демонстрират, че IL-17A е главният регулатор на имунитета срещу G. muris, индуцира IL-17RA сигнализиране, произвежда антимикробни пептиди и регулира активирането на комплемента [51].Въпреки това, инфекцията с Giardia се среща по-често при млади възрастни и се съобщава, че инфекцията с Giardia при млади мишки не активира отговора на IL-17A, за да упражни своя защитен ефект [52], което подтиква изследователите да търсят други имуномодулиращи Giardia.механизми на инфекция с хелминти.Авторите на скорошно проучване съобщават, че G. muris може да активира инфламазомата NLRP3 от E. coli EPEC, което насърчава производството на антимикробни пептиди и намалява капацитета на прикрепване и броя на трофозоитите в чревния тракт, като по този начин намалява тежестта на дебелото черво заболявания, причинени от бацили [49].Инфламазомата NLRP3 участва в развитието на различни заболявания.Проучванията показват, че Pseudomonas aeruginosa предизвиква аутофагия в макрофагите, за да се избегне клетъчната смърт, и този процес зависи от активирането на инфламазомата NLRP3 [53].За N. caninum медиираното от реактивни кислородни видове активиране на NLRP3 инфламазома ограничава репликацията му в гостоприемника, което го прави потенциална терапевтична цел [9].Установено е, че Paracoccidioides brasiliensis индуцира активирането на инфламазомата NLRP3 в дендритни клетки, получени от костен мозък на мишка, което води до освобождаване на възпалителния цитокин IL-1β, който играе критична роля в защитата на гостоприемника [10].Няколко вида Leishmania, включително L. amazonensis, L. major, L. braziliensis и L. infantum chagasi, активират NLRP3 и ASC-зависимата каспаза-1 в макрофагите, както и инфекцията с Leishmania.Репликацията на паразити се засилва при мишки с дефицит на NLRP3/ASC/caspase-1 ген [11].Zamboni и др.Съобщава се, че инфекцията с Leishmania индуцира активиране на NLRP3 инфламазома в макрофагите, което ограничава репликацията на вътреклетъчния паразит.По този начин Leishmania може да инхибира активирането на NLRP3 като стратегия за избягване.При in vivo проучвания инфламазомата NLRP3 допринася за елиминирането на Leishmania, но не засяга тъканите [54].Обратно, при проучвания за хелминтиаза, активирането на инфламазомата NLRP3 потиска защитния имунитет на гостоприемника срещу стомашно-чревни хелминтози [12].Shigella е една от основните бактерии, причиняващи диария в световен мащаб.Тези бактерии могат да индуцират производството на IL-1β чрез медииран от P2X7 рецептор K+ изтичане, реактивни кислородни видове, лизозомно подкисляване и митохондриално увреждане.Инфламазомата NLRP3 регулира негативно фагоцитозата и бактерицидната активност на макрофагите срещу Shigella [55].Изследванията на Plasmodium показват, че AIM2, NLRP3 или мишки с дефицит на каспаза-1, заразени с Plasmodium, произвеждат високи нива на интерферон тип 1 и са по-устойчиви на инфекция с Plasmodium [56].Въпреки това, ролята на алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин в индуцирането на патогенно активиране на NLRP3 възпаление при мишки е неясна.
В това проучване, инхибирането на NLRP3 инфламазома от MCC950 намалява BW и увеличава броя на трофозоитите в чревната промивна течност при мишки, което води до по-тежки патологични промени в дуоденалната тъкан.Алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин активират NLRP3 инфламазома на мишка гостоприемник, увеличават телесното тегло на мишката, намаляват броя на трофозоитите в чревната промивна течност и облекчават патологичните дуоденални лезии.Тези резултати предполагат, че G. duodenalis може да активира инфламазомата на гостоприемника NLRP3 чрез алфа-2 гиардин и алфа-7,3 гиардин, намалявайки патогенността на G. duodenalis при мишки.
Взети заедно, нашите резултати показват, че алфа-2 и алфа-7.3 giardine индуцират активирането на инфламазомата на гостоприемника NLRP3 и намаляват инфекциозността на G. duodenalis при мишки.Следователно, тези молекули са обещаващи цели за превенция на лямблиоза.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Лямблиоза: преглед.Наскоро беше разкрито, че Пат Инфлам е алергичен към лекарства.2019; 13: 134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: преглед на фармакотерапията.Експертно мнение на фармацевт.2007 г.;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Лямблиоза, лекарствена резистентност и откриване на нови цели.Заразява мишените на наркотици Disord.2010; 10: 295-302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T и др. NLRP3 инфламазома и възпалителни заболявания.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Ролята на инфламазомата при чревно възпаление и рак.Гастроентерология.2011 г.;141:1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Канонично и атипично активиране на възпаление на NLRP3 на кръстопътя на имунната толерантност и възпалението на червата.предимунен.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S и др.ROS-медиирано NLRP3 инфламазомно активиране е включено в отговор на инфекция с N. caninum.Паразити вектор.2020; 13: 449.