Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Генните вектори за лечение на белодробна кистозна фиброза трябва да бъдат насочени към проводимите дихателни пътища, тъй като периферната белодробна трансдукция няма терапевтичен ефект.Ефективността на вирусната трансдукция е пряко свързана с времето на престой на носителя.Въпреки това, доставящи течности като генни носители естествено дифундират в алвеолите по време на вдишване и терапевтичните частици с всякаква форма се отстраняват бързо чрез мукоцилиарен транспорт.Удължаването на времето на престой на генните носители в респираторния тракт е важно, но трудно постижимо.Магнитни частици, свързани с носител, които могат да бъдат насочени към повърхността на дихателните пътища, могат да подобрят регионалното насочване.Поради проблеми с in vivo изображения, поведението на такива малки магнитни частици върху повърхността на дихателните пътища в присъствието на приложено магнитно поле е слабо разбрано.Целта на това изследване беше да се използва синхротронно изображение за визуализиране in vivo на движението на серия от магнитни частици в трахеята на анестезирани плъхове, за да се изследват динамиката и моделите на поведение на единични и насипни частици in vivo.След това също така оценихме дали доставянето на лентивирусни магнитни частици в присъствието на магнитно поле ще увеличи ефективността на трансдукцията в трахеята на плъх.Синхротронното рентгеново изображение показва поведението на магнитните частици в стационарни и движещи се магнитни полета in vitro и in vivo.Частиците не могат лесно да се влачат по повърхността на живите дихателни пътища с помощта на магнити, но по време на транспортиране отлаганията се концентрират в зрителното поле, където магнитното поле е най-силно.Ефективността на трансдукция също се увеличава шест пъти, когато лентивирусните магнитни частици се доставят в присъствието на магнитно поле.Взети заедно, тези резултати предполагат, че лентивирусните магнитни частици и магнитните полета могат да бъдат ценни подходи за подобряване на насочването на генния вектор и нивата на трансдукция в проводимите дихателни пътища in vivo.
Кистозната фиброза (CF) се причинява от вариации в един ген, наречен CF трансмембранен регулатор на проводимостта (CFTR).Протеинът CFTR е йонен канал, който присъства в много епителни клетки в цялото тяло, включително дихателните пътища, основно място в патогенезата на кистозната фиброза.Дефектите в CFTR водят до необичаен воден транспорт, дехидратация на повърхността на дихателните пътища и намалена дълбочина на повърхностния флуиден слой (ASL) на дихателните пътища.Той също така нарушава способността на мукоцилиарната транспортна система (MCT) да изчисти дихателните пътища от вдишани частици и патогени.Нашата цел е да разработим лентивирусна (LV) генна терапия, за да предоставим правилното копие на CFTR гена и да подобрим ASL, MCT и здравето на белите дробове и да продължим да разработваме нови технологии, които могат да измерват тези параметри in vivo1.
LV векторите са едни от водещите кандидати за генна терапия на кистозна фиброза, главно защото могат да интегрират трайно терапевтичния ген в базалните клетки на дихателните пътища (стволови клетки на дихателните пътища).Това е важно, защото те могат да възстановят нормалната хидратация и клирънс на слуз чрез диференциране във функционални генно-коригирани повърхностни клетки на дихателните пътища, свързани с кистозна фиброза, което води до ползи през целия живот.LV векторите трябва да бъдат насочени срещу проводимите дихателни пътища, тъй като това е мястото, където започва белодробното засягане при CF.Доставянето на вектора по-дълбоко в белия дроб може да доведе до алвеоларна трансдукция, но това няма терапевтичен ефект при кистозна фиброза.Въпреки това, течности като генни носители естествено мигрират в алвеолите при вдишване след раждането3,4 и терапевтичните частици бързо се изхвърлят в устната кухина от MCT.Ефективността на LV трансдукция е пряко свързана с продължителността на времето, през което векторът остава близо до целевите клетки, за да позволи клетъчно поглъщане – „време на престой“ 5, което лесно се съкращава от типичния регионален въздушен поток, както и координирано поемане на слуз и MCT частици.За кистозната фиброза способността за удължаване на времето на престой на LV в дихателните пътища е важна за постигане на високи нива на трансдукция в тази област, но досега е била предизвикателство.
За да се преодолее това препятствие, ние предлагаме LV магнитните частици (MP) да помогнат по два допълващи се начина.Първо, те могат да бъдат насочвани от магнит към повърхността на дихателните пътища, за да подобрят насочването и да помогнат на частиците носители на гени да бъдат в правилната област на дихателните пътища;и ASL) се преместват в клетъчен слой 6. MPs се използват широко като носители за целево доставяне на лекарства, когато се свързват с антитела, лекарства за химиотерапия или други малки молекули, които се прикрепят към клетъчните мембрани или се свързват към съответните им рецептори на клетъчната повърхност и се натрупват в местата на тумора в наличие на статично електричество.Магнитни полета за лечение на рак 7. Други „хипертермични“ методи са насочени към унищожаване на туморни клетки чрез нагряване на MP, когато са изложени на осцилиращи магнитни полета.Принципът на магнитна трансфекция, при който магнитно поле се използва като трансфекционен агент за подобряване на трансфера на ДНК в клетките, обикновено се използва in vitro, като се използва набор от невирусни и вирусни генни вектори за трудни за трансдуциране клетъчни линии ..Установена е ефективността на LV магнитотрансфекция с доставяне на LV MP in vitro в клетъчна линия на човешки бронхиален епител в присъствието на статично магнитно поле, което повишава ефективността на трансдукцията 186 пъти в сравнение само с LV вектора.LV MT също е приложен към in vitro модел на кистозна фиброза, където магнитната трансфекция увеличава LV трансдукцията в културите на повърхността въздух-течност с фактор 20 в присъствието на храчка от кистозна фиброза10.Въпреки това, in vivo магнитотрансфекцията на органи е получила сравнително малко внимание и е била оценена само в няколко проучвания върху животни11,12,13,14,15, особено в белите дробове16,17.Въпреки това, възможностите за магнитна трансфекция в белодробната терапия при кистозна фиброза са ясни.Тан и др.(2020) заявява, че „проучване за валидиране на ефективно белодробно доставяне на магнитни наночастици ще проправи пътя за бъдещи стратегии за инхалиране на CFTR за подобряване на клиничните резултати при пациенти с кистозна фиброза“6.
Поведението на малките магнитни частици на повърхността на дихателните пътища в присъствието на приложено магнитно поле е трудно за визуализиране и изследване и поради това те са слабо разбрани.В други проучвания ние разработихме метод за фазово контрастно рентгеново изображение на базата на синхротронно разпространение (PB-PCXI) за неинвазивно изобразяване и количествено определяне на малки in vivo промени в дълбочината на ASL18 и поведението на MCT19,20 за директно измерване на повърхностната хидратация на газовия канал и се използва като ранен показател за ефективността на лечението.В допълнение, нашият метод за оценка на MCT използва частици с диаметър 10–35 µm, съставени от алуминиев оксид или стъкло с висок индекс на пречупване като MCT маркери, видими с PB-PCXI21.И двата метода са подходящи за изобразяване на редица видове частици, включително MP.
Благодарение на високата пространствена и времева разделителна способност, нашите базирани на PB-PCXI ASL и MCT анализи са много подходящи за изследване на динамиката и поведенческите модели на единични и насипни частици in vivo, за да ни помогнат да разберем и оптимизираме методите за доставяне на MP ген.Подходът, който използваме тук, се основава на нашите проучвания с помощта на лъчева линия SPring-8 BL20B2, в която визуализирахме движение на течности след доставяне на доза от фиктивен вектор в назалните и белодробните дихателни пътища на мишки, за да помогнем да обясним нашите наблюдавани хетерогенни модели на генна експресия в нашия ген.проучвания при животни с носеща доза от 3,4 .
Целта на това проучване беше да се използва PB-PCXI синхротрон за визуализиране in vivo движения на серия от MP в трахеята на живи плъхове.Тези PB-PCXI образни изследвания са предназначени да тестват серията MP, силата на магнитното поле и местоположението, за да определят ефекта им върху движението на MP.Приехме, че външно магнитно поле ще помогне на доставения MF да остане или да се премести в целевата област.Тези изследвания също ни позволиха да определим магнитни конфигурации, които максимизират количеството частици, останали в трахеята след отлагането.Във втора серия от проучвания, ние имахме за цел да използваме тази оптимална конфигурация, за да демонстрираме модела на трансдукция в резултат на in vivo доставка на LV-MPs в дихателните пътища на плъхове, при допускането, че доставянето на LV-MPs в контекста на насочване на дихателните пътища ще доведе в повишена ефективност на LV трансдукция..
Всички проучвания върху животни са проведени в съответствие с протоколи, одобрени от Университета на Аделаида (M-2019-060 и M-2020-022) и Комитета по етика на животните SPring-8 Synchrotron.Експериментите са проведени в съответствие с препоръките на ARRIVE.
Всички рентгенови изображения са направени на линията на лъча BL20XU на синхротрона SPring-8 в Япония, като се използва настройка, подобна на описаната по-рано 21, 22.Накратко, експерименталната кутия беше разположена на 245 m от синхротронния пръстен за съхранение.Разстоянието от проба до детектор от 0,6 m се използва за изследвания с изображения на частици и 0,3 m за in vivo изследвания с изображения за създаване на фазови контрастни ефекти.Използван е монохроматичен лъч с енергия 25 keV.Изображенията са получени с помощта на рентгенов трансдюсер с висока разделителна способност (SPring-8 BM3), свързан към sCMOS детектор.Преобразувателят преобразува рентгеновите лъчи във видима светлина с помощта на сцинтилатор с дебелина 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), който след това се насочва към sCMOS сензора с помощта на ×10 (NA 0,3) микроскопски обектив.Детекторът sCMOS беше Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япония) с размер на масива от 2048 × 2048 пиксела и необработен размер на пиксела от 6,5 × 6,5 µm.Тази настройка дава ефективен изотропен размер на пиксела от 0,51 µm и зрително поле от приблизително 1,1 mm × 1,1 mm.Продължителността на експозицията от 100 ms беше избрана, за да се увеличи максимално съотношението сигнал/шум на магнитните частици вътре и извън дихателните пътища, като същевременно се минимизират артефактите на движение, причинени от дишането.За in vivo проучвания, бърз рентгенов затвор беше поставен в пътя на рентгеновите лъчи, за да ограничи дозата на радиация чрез блокиране на рентгеновия лъч между експозициите.
LV среда не е използвана в нито едно SPring-8 PB-PCXI образно изследване, тъй като камерата за изображения BL20XU не е сертифицирана за ниво 2 на биобезопасност.Вместо това избрахме набор от добре характеризирани MP от двама търговски доставчици, покриващи набор от размери, материали, концентрации на желязо и приложения - първо, за да разберем как магнитните полета влияят на движението на MP в стъклени капиляри, а след това в живи дихателни пътища.повърхност.Размерът на MP варира от 0,25 до 18 µm и е направен от различни материали (вижте таблица 1), но съставът на всяка проба, включително размерът на магнитните частици в MP, не е известен.Въз основа на нашите обширни MCT проучвания 19, 20, 21, 23, 24, ние очакваме, че MPs до 5 µm могат да се видят на повърхността на трахеалните дихателни пътища, например чрез изваждане на последователни кадри, за да се види подобрена видимост на движението на MP.Единичен MP от 0,25 µm е по-малък от разделителната способност на устройството за изображения, но се очаква PB-PCXI да открие техния обемен контраст и движението на повърхностната течност, върху която са отложени, след като бъдат отложени.
Образци за всеки депутат в таблицата.1 се приготвя в 20 μl стъклени капиляри (Drummond Microcaps, PA, САЩ) с вътрешен диаметър 0, 63 mm.Корпускулярните частици се предлагат във вода, докато CombiMag частиците се предлагат в собствената течност на производителя.Всяка епруветка се пълни наполовина с течност (приблизително 11 µl) и се поставя върху държача на пробата (вижте Фигура 1).Стъклените капиляри бяха поставени съответно хоризонтално на сцената в камерата за изображения и разположени в краищата на течността.Магнит с никелова обвивка с диаметър 19 mm (28 mm дължина), изработен от рядкоземни метали, неодим, желязо и бор (NdFeB) (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) с остатъчна устойчивост от 1,17 T беше прикрепен към отделна таблица за прехвърляне, за да постигнете Дистанционна промяна на позицията ви по време на изобразяване.Рентгеновото изобразяване започва, когато магнитът е позициониран приблизително на 30 mm над пробата и изображенията се получават при 4 кадъра в секунда.По време на изобразяването магнитът беше доближен до стъклената капилярна тръба (на разстояние около 1 mm) и след това се премести по тръбата, за да се оцени ефектът от силата на полето и позицията.
Ин витро настройка за изображения, съдържаща MP проби в стъклени капиляри на етапа на транслация на xy пробата.Пътят на рентгеновия лъч е маркиран с червена пунктирана линия.
След като беше установена in vitro видимостта на MPs, подгрупа от тях беше тествана in vivo върху див тип женски плъхове Wistar албиноси (~12 седмични, ~200 g).Медетомидин 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Япония), мидазолам 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Япония) и буторфанол 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Плъховете бяха анестезирани със смес Pharma (Япония) чрез интраперитонеална инжекция.След анестезия те бяха подготвени за образна диагностика чрез отстраняване на козината около трахеята, вмъкване на ендотрахеална тръба (ET; 16 Ga интравенозна канюла, Terumo BCT) и обездвижването им в легнало положение върху специално изработена пластина за изображения, съдържаща термична торба за поддържане на телесната температура.22. Плаката за изображения след това беше прикрепена към етапа на пробата в кутията за изображения под лек ъгъл, за да подравни трахеята хоризонтално върху рентгеновото изображение, както е показано на Фигура 2а.
( а ) Настройка на изображения in vivo в модула за изображения SPring-8, пътят на рентгеновия лъч е маркиран с червена пунктирана линия.(b, c) Локализацията на трахеалния магнит се извършва дистанционно с помощта на две ортогонално монтирани IP камери.От лявата страна на изображението на екрана можете да видите телената примка, държаща главата, и канюлата за доставяне, инсталирана вътре в ET тръбата.
Дистанционно управлявана помпена система със спринцовка (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), използваща 100 µl стъклена спринцовка, беше свързана към PE10 тръба (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) с помощта на 30 Ga игла.Маркирайте тръбата, за да сте сигурни, че върхът е в правилната позиция в трахеята, когато поставяте ендотрахеалната тръба.Използвайки микропомпа, буталото на спринцовката се отстранява и върхът на епруветката се потапя в МР пробата, която трябва да бъде доставена.След това заредената тръба за доставяне беше вкарана в ендотрахеалната тръба, поставяйки върха в най-силната част на нашето очаквано приложено магнитно поле.Получаването на изображение се контролира с помощта на детектор за дишане, свързан към нашата базирана на Arduino кутия за синхронизиране, и всички сигнали (напр. температура, дишане, отворен/затворен затвор и придобиване на изображение) се записват с помощта на Powerlab и LabChart (AD Instruments, Сидни, Австралия) 22 При изображения Когато корпусът не беше наличен, две IP камери (Panasonic BB-SC382) бяха позиционирани на приблизително 90° една спрямо друга и използвани за контролиране на позицията на магнита спрямо трахеята по време на изображения (Фигура 2b, c).За да се сведат до минимум артефактите на движение, се получава едно изображение на вдишване по време на крайното плато на респираторния поток.
Магнитът е прикрепен към втория етап, който може да бъде разположен отдалечено от външната страна на тялото за изображения.Бяха тествани различни позиции и конфигурации на магнита, включително: поставен под ъгъл от приблизително 30° над трахеята (конфигурациите са показани на фигури 2а и 3а);един магнит над животното, а другият отдолу, с полюсите, настроени за привличане (Фигура 3b)., един магнит над животното и един отдолу, с полюсите, настроени за отблъскване (Фигура 3c), и един магнит над и перпендикулярно на трахеята (Фигура 3d).След поставяне на животното и магнита и зареждане на тествания MP в помпата на спринцовката, дайте доза от 50 µl със скорост 4 µl/сек при получаване на изображения.След това магнитът се движи напред-назад по протежение или напречно на трахеята, докато продължава да получава изображения.
Конфигурация на магнит за in vivo изображения (a) един магнит над трахеята под ъгъл от приблизително 30°, (b) два магнита, конфигурирани за привличане, (c) два магнита, конфигурирани за отблъскване, (d) един магнит над и перпендикулярно на трахеята.Наблюдателят погледна надолу от устата към белите дробове през трахеята и рентгеновият лъч премина през лявата страна на плъха и излезе от дясната страна.Магнитът се движи или по дължината на дихателния път, или наляво и надясно над трахеята по посока на рентгеновия лъч.
Също така се опитахме да определим видимостта и поведението на частиците в дихателните пътища при липса на смесване на дишане и сърдечен ритъм.Следователно, в края на периода на изобразяване, животните бяха хуманно евтаназирани поради предозиране с пентобарбитал (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, САЩ; ~65 mg/kg ip).Някои животни бяха оставени на платформата за изображения и след спиране на дишането и сърдечния ритъм процесът на изобразяване беше повторен, като се добави допълнителна доза MP, ако не се вижда MP на повърхността на дихателните пътища.
Получените изображения бяха коригирани за плоско и тъмно поле и след това сглобени във филм (20 кадъра в секунда; 15–25 × нормална скорост в зависимост от честотата на дишане) с помощта на персонализиран скрипт, написан в MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Всички проучвания върху доставката на LV генен вектор бяха проведени в Центъра за лабораторни изследвания на животни на Университета на Аделаида и имаха за цел да използват резултатите от експеримента SPring-8, за да преценят дали доставката на LV-MP в присъствието на магнитно поле може да подобри генния трансфер in vivo .За да се оценят ефектите от MF и магнитното поле, бяха третирани две групи животни: едната група беше инжектирана с LV MF с поставяне на магнит, а другата група беше инжектирана с контролна група с LV MF без магнит.
LV генните вектори са генерирани с помощта на описани по-рано методи 25, 26.Векторът LacZ експресира ядрено локализиран бета-галактозидазен ген, задвижван от MPSV конститутивния промотор (LV-LacZ), който произвежда син реакционен продукт в трансдуцирани клетки, видими на фронтовете и участъците на белодробната тъкан.Титруването се извършва в клетъчни култури чрез ръчно преброяване на броя на LacZ-позитивните клетки с помощта на хемоцитометър за изчисляване на титъра в TU/ml.Носителите се криоконсервират при -80°C, размразяват се преди употреба и се свързват с CombiMag чрез смесване 1:1 и инкубиране върху лед за най-малко 30 минути преди доставяне.
Нормални плъхове Sprague Dawley (n = 3/група, ~2-3 анестезирани ip със смес от 0,4 mg/kg медетомидин (Domitor, Ilium, Австралия) и 60 mg/kg кетамин (Ilium, Австралия) на възраст 1 месец) ip ) инжектиране и нехирургично орално канюлиране с 16 Ga интравенозна канюла.За да се гарантира, че тъканта на трахеалните дихателни пътища получава LV трансдукция, тя беше кондиционирана с помощта на описания по-рано протокол за механични смущения, при който повърхността на трахеалните дихателни пътища се търка аксиално с телена кошница (N-кръг, нитинолов екстрактор за камъни без накрайник NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, САЩ) 30 стр.28.След това, около 10 минути след смущението в шкафа за биобезопасност, беше извършено трахеално приложение на LV-MP.
Магнитното поле, използвано в този експеримент, е конфигурирано подобно на in vivo рентгеново изследване, като същите магнити се държат върху трахеята с дестилационни скоби за стент (Фигура 4).Обем от 50 µl (2 х 25 µl аликвотни части) от LV-MP се доставя в трахеята (n = 3 животни), като се използва пипета с гел-върх, както е описано по-горе.Контролната група (n = 3 животни) получи същия LV-MP без използването на магнит.След завършване на инфузията, канюлата се отстранява от ендотрахеалната тръба и животното се екстубира.Магнитът остава на място за 10 минути, преди да бъде изваден.На плъховете се прилага подкожно мелоксикам (1 ml/kg) (Ilium, Австралия), последвано от отнемане на анестезията чрез интраперитонеално инжектиране на 1 mg/kg атипамазол хидрохлорид (Antisedan, Zoetis, Австралия).Плъховете се държат на топло и се наблюдават до пълно възстановяване от анестезията.
Устройство за доставяне LV-MP в шкаф за биологична безопасност.Можете да видите, че светлосивият Luer-lock маншон на ET тръбата излиза от устата, а върхът на гел пипетата, показан на фигурата, се вкарва през ET тръбата до желаната дълбочина в трахеята.
Една седмица след процедурата на прилагане на LV-MP, животните бяха хуманно умъртвени чрез вдишване на 100% CO2 и експресията на LacZ беше оценена с помощта на нашето стандартно X-gal лечение.Трите най-опашни хрущялни пръстена бяха отстранени, за да се гарантира, че всяко механично увреждане или задържане на течности поради поставянето на ендотрахеална тръба няма да бъдат включени в анализа.Всяка трахея се разрязва по дължина, за да се получат две половини за анализ и се поставя в чаша, съдържаща силиконова гума (Sylgard, Dow Inc), като се използва игла Minutien (Fine Science Tools), за да се визуализира луминалната повърхност.Разпределението и характерът на трансдуцираните клетки бяха потвърдени чрез фронтална фотография с помощта на микроскоп Nikon (SMZ1500) с камера DigiLite и софтуер TCapture (Tucsen Photonics, Китай).Изображенията бяха получени при 20-кратно увеличение (включително максималната настройка за пълната ширина на трахеята), като цялата дължина на трахеята се показваше стъпка по стъпка, осигурявайки достатъчно припокриване между всяко изображение, за да позволи изображенията да бъдат „зашити“.След това изображенията от всяка трахея бяха комбинирани в едно съставно изображение с помощта на Composite Image Editor версия 2.0.3 (Microsoft Research), използвайки алгоритъма за планарно движение. Областта на експресия на LacZ в съставните изображения на трахеята от всяко животно беше количествено определена с помощта на автоматизиран скрипт MATLAB (R2020a, MathWorks), както беше описано по-горе 28, като се използват настройки от 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 и Value < 0,7. Площта на експресия на LacZ в съставните изображения на трахеята от всяко животно беше количествено определена с помощта на автоматизиран скрипт MATLAB (R2020a, MathWorks), както е описано по-рано 28, като се използват настройки от 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 и Value < 0,7. Площадка на експреси LacZ в съставните изображения на трахеи от всяко животно е количествено определена с използване на автоматизиран сценарий MATLAB (R2020a, MathWorks), както е описано по-рано28, с настройки с използване на 0,35 <оттенок <0,58, наситеност> 0,15 и <0 ,7. Площта на експресия на LacZ в съставни трахеални изображения от всяко животно беше количествено определена с помощта на автоматизиран MATLAB скрипт (R2020a, MathWorks), както беше описано по-рано28, използвайки настройки от 0,350,15 и стойност <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（R2020A ， Mathworks） 来自 每 只 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 表达 表达 量化 使用 使用 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的 的.................... ХИП Областите на експресия на LacZ в съставните изображения на трахеите на всяко животно количество, определени с автоматизирано използване на сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), както беше описано по-рано, с използване на настройки 0,35 <оттенок <0,58, наситеност> 0,15 и значение <0,7 . Областите на експресия на LacZ върху съставни изображения на трахеята на всяко животно бяха количествено определени с помощта на автоматизиран скрипт MATLAB (R2020a, MathWorks), както е описано по-рано, като се използват настройки от 0,35 <оттенък <0,58, наситеност> 0,15 и стойност <0,7.Чрез проследяване на тъканните контури в GIMP v2.10.24, ръчно беше създадена маска за всяко съставно изображение, за да се идентифицира тъканната област и да се предотвратят всякакви фалшиви откривания извън трахеалната тъкан.Оцветените площи от всички съставни изображения от всяко животно бяха сумирани, за да се получи общата оцветена площ за това животно.След това боядисаната площ беше разделена на общата площ на маската, за да се получи нормализирана площ.
Всяка трахея беше вградена в парафин и нарязана с дебелина 5 µm.Секциите бяха насрещно оцветени с неутрално бързо червено за 5 минути и изображенията бяха получени с помощта на микроскоп Nikon Eclipse E400, DS-Fi3 камера и NIS софтуер за улавяне на елементи (версия 5.20.00).
Всички статистически анализи бяха извършени в GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Статистическата значимост беше определена на p ≤ 0.05.Нормалността беше тествана с помощта на теста на Shapiro-Wilk и разликите в оцветяването с LacZ бяха оценени с помощта на несдвоен t-тест.
Шестте MP, описани в таблица 1, бяха изследвани от PCXI, а видимостта е описана в таблица 2. Две полистиренови MP (MP1 и MP2; съответно 18 µm и 0,25 µm) не бяха видими от PCXI, но останалите проби можеха да бъдат идентифицирани (примерите са показани на фигура 5).MP3 и MP4 са слабо видими (10-15% Fe3O4; съответно 0,25 µm и 0,9 µm).Въпреки че MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) съдържа някои от най-малките тествани частици, той е най-ясно изразен.Продуктът CombiMag MP6 е трудно различим.Във всички случаи способността ни да откриваме MF беше значително подобрена чрез преместване на магнита напред и назад успоредно на капиляра.Когато магнитите се отдалечиха от капиляра, частиците бяха изтеглени в дълги вериги, но когато магнитите се приближиха и силата на магнитното поле се увеличи, веригите на частиците се скъсиха, докато частиците мигрираха към горната повърхност на капиляра (вижте Допълнително видео S1 : MP4), увеличавайки плътността на частиците на повърхността.Обратно, когато магнитът се отстрани от капиляра, силата на полето намалява и MPs се пренареждат в дълги вериги, простиращи се от горната повърхност на капиляра (вижте Допълнително видео S2: MP4).След като магнитът спре да се движи, частиците продължават да се движат известно време след достигане на равновесно положение.Докато MP се движи към и далеч от горната повърхност на капиляра, магнитните частици са склонни да изтеглят отломки през течността.
Видимостта на MP под PCXI варира значително между пробите.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 и (d) MP6.Всички показани тук изображения са направени с магнит, разположен приблизително на 10 mm директно над капиляра.Видимите големи кръгове са въздушни мехурчета, уловени в капилярите, ясно показващи черно-белите ръбове на изображението с фазов контраст.Червеното поле показва увеличението, което подобрява контраста.Имайте предвид, че диаметрите на магнитните вериги на всички фигури не са в мащаб и са приблизително 100 пъти по-големи от показаното.
Докато магнитът се движи наляво и надясно по горната част на капиляра, ъгълът на MP низа се променя, за да се изравни с магнита (вижте Фигура 6), като по този начин очертава линиите на магнитното поле.За MP3-5, след като хордата достигне праговия ъгъл, частиците се влачат по горната повърхност на капиляра.Това често води до групиране на MP в по-големи групи близо до мястото, където магнитното поле е най-силно (вижте Допълнително видео S3: MP5).Това също е особено очевидно при изобразяване близо до края на капиляра, което кара МП да се агрегира и концентрира в интерфейса течност-въздух.Частиците в MP6, които бяха по-трудни за разграничаване от тези в MP3-5, не се влачеха, когато магнитът се движеше по капиляра, но MP струните се дисоциираха, оставяйки частиците в полезрението (вижте Допълнително видео S4: MP6).В някои случаи, когато приложеното магнитно поле беше намалено чрез преместване на магнита на голямо разстояние от мястото за изобразяване, всички останали MP бавно се спуснаха към долната повърхност на тръбата чрез гравитация, оставайки в низа (вижте Допълнително видео S5: MP3) .
Ъгълът на MP струната се променя, когато магнитът се движи надясно над капиляра.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 и (d) MP6.Червеното поле показва увеличението, което подобрява контраста.Моля, имайте предвид, че допълнителните видеоклипове са с информационна цел, тъй като те разкриват важна структура на частиците и динамична информация, която не може да бъде визуализирана в тези статични изображения.
Нашите тестове показаха, че бавното движение на магнита напред-назад по трахеята улеснява визуализацията на МФ в контекста на сложно движение in vivo.Не са проведени in vivo тестове, тъй като полистиролови зърна (MP1 и MP2) не са видими в капиляра.Всяка от останалите четири MF беше тествана in vivo с дългата ос на магнита, разположена над трахеята под ъгъл от около 30° спрямо вертикалата (вижте фигури 2b и 3a), тъй като това доведе до по-дълги MF вериги и беше по-ефективно отколкото магнит..конфигурацията е прекратена.MP3, MP4 и MP6 не са открити в трахеята на живи животни.При визуализиране на дихателните пътища на плъхове след хуманно умъртвяване на животните, частиците остават невидими дори когато се добавя допълнителен обем с помощта на помпа за спринцовка.MP5 имаше най-високото съдържание на железен оксид и беше единствената видима частица, така че беше използвана за оценка и характеризиране на поведението на MP in vivo.
Поставянето на магнита върху трахеята по време на поставянето на MF доведе до концентриране на много, но не всички, MF в зрителното поле.Навлизането на частици в трахеята се наблюдава най-добре при хуманно евтаназирани животни.Фигура 7 и допълнителен видеоклип S6: MP5 показва бързо магнитно улавяне и подравняване на частици на повърхността на вентралната трахея, което показва, че MPs могат да бъдат насочени към желаните области на трахеята.При търсене по-дистално по протежение на трахеята след доставка на MF, някои MFs бяха открити по-близо до карината, което показва недостатъчна сила на магнитното поле за събиране и задържане на всички MFs, тъй като те бяха доставени през областта на максимална сила на магнитното поле по време на прилагане на течност.процес.Въпреки това, постнаталните концентрации на MP са по-високи около зоната на изображението, което предполага, че много MP остават в регионите на дихателните пътища, където силата на приложеното магнитно поле е най-висока.
Изображения на (a) преди и (b) след доставяне на MP5 в трахеята на наскоро евтаназиран плъх с магнит, поставен точно над зоната за изображения.Изобразеният участък е разположен между два хрущялни пръстена.Има малко течност в дихателните пътища преди МП да бъде доставен.Червеното поле показва увеличението, което подобрява контраста.Тези изображения са взети от видеоклипа, представен в S6: MP5 Допълнителен видеоклип.
Преместването на магнита по протежение на трахеята in vivo доведе до промяна в ъгъла на МР веригата върху повърхността на дихателните пътища, подобно на наблюдаваното в капилярите (вижте Фигура 8 и Допълнително видео S7: MP5).Въпреки това, в нашето проучване MPs не могат да бъдат влачени по повърхността на живите дихателни пътища, както могат да направят капилярите.В някои случаи MP веригата се удължава, когато магнитът се движи наляво и надясно.Интересното е, че открихме също, че веригата на частиците променя дълбочината на повърхностния слой на течността, когато магнитът се движи надлъжно по трахеята, и се разширява, когато магнитът се движи директно над главата и веригата на частиците се завърта във вертикална позиция (вижте Допълнително видео S7).: MP5 на 0:09, долу вдясно).Характерният модел на движение се промени, когато магнитът се премести странично през горната част на трахеята (т.е. отляво или отдясно на животното, а не по дължината на трахеята).Частиците все още бяха ясно видими по време на движението им, но когато магнитът беше изваден от трахеята, върховете на струните на частиците станаха видими (вижте Допълнително видео S8: MP5, започвайки от 0:08).Това е в съответствие с наблюдаваното поведение на магнитното поле под действието на приложено магнитно поле в стъклен капиляр.
Примерни изображения, показващи MP5 в трахеята на жив анестезиран плъх.(a) Магнитът се използва за получаване на изображения над и отляво на трахеята, след това (b) след преместване на магнита надясно.Червеното поле показва увеличението, което подобрява контраста.Тези изображения са от видеоклипа, включен в допълнителното видео на S7: MP5.
Когато двата полюса бяха настроени в ориентация север-юг над и под трахеята (т.е. привличане; Фиг. 3b), MP хордите изглеждаха по-дълги и бяха разположени на страничната стена на трахеята, а не на дорзалната повърхност на трахеята. трахея (вижте Приложението).Видео S9:MP5).Въпреки това, високи концентрации на частици на едно място (т.е. дорзалната повърхност на трахеята) не са открити след прилагане на течност с помощта на устройство с двоен магнит, което обикновено се случва с устройство с един магнит.След това, когато един магнит беше конфигуриран да отблъсква противоположните полюси (Фигура 3c), броят на частиците, видими в зрителното поле, не се увеличи след доставката.Настройването на двете магнитни конфигурации е предизвикателство поради високата сила на магнитното поле, което съответно привлича или избутва магнитите.След това настройката беше променена на единичен магнит, успореден на дихателните пътища, но преминаващ през дихателните пътища под ъгъл от 90 градуса, така че силовите линии да пресичат стената на трахеята ортогонално (Фигура 3d), ориентация, предназначена да определи възможността за агрегиране на частици върху страничната стена.да се наблюдават.В тази конфигурация обаче не е имало разпознаваемо движение на натрупване на MF или движение на магнит.Въз основа на всички тези резултати беше избрана конфигурация с единичен магнит и 30-градусова ориентация за in vivo изследвания на генни носители (фиг. 3а).
Когато животното беше изобразено многократно веднага след като беше хуманно умъртвено, липсата на пречещо движение на тъканта означаваше, че по-фини, по-къси линии на частици могат да бъдат разпознати в ясното междухрущялно поле, „люлеещи се“ в съответствие с транслационното движение на магнита.ясно виждат присъствието и движението на MP6 частици.
Титърът на LV-LacZ е 1,8 х 108 IU/mL и след смесване 1:1 с CombiMag MP (MP6), животните се инжектират с 50 µl трахеална доза от 9 х 107 IU/ml LV носител (т.е. 4,5 x 106 TU/плъх).).).В тези проучвания, вместо да движим магнита по време на раждането, ние фиксирахме магнита в една позиция, за да определим дали LV трансдукцията може (а) да се подобри в сравнение с векторното доставяне в отсъствието на магнитно поле и (б) дали дихателните пътища могат бъдете фокусирани.Клетките се трансдуцират в магнитните целеви области на горните дихателни пътища.
Наличието на магнити и използването на CombiMag в комбинация с LV вектори изглежда не оказват неблагоприятно влияние върху здравето на животните, както и нашият стандартен протокол за доставка на LV вектор.Фронталните изображения на трахеалната област, подложена на механично смущение (допълнителна фигура 1), показват, че групата, третирана с LV-MP, има значително по-високи нива на трансдукция в присъствието на магнит (фиг. 9а).Само малко количество синьо оцветяване с LacZ присъства в контролната група (Фигура 9b).Количественото определяне на X-Gal-оцветени нормализирани региони показва, че прилагането на LV-MP в присъствието на магнитно поле води до приблизително 6-кратно подобрение (фиг. 9с).
Пример за съставни изображения, показващи трахеална трансдукция с LV-MP (a) в присъствието на магнитно поле и (b) в отсъствието на магнит.(c) Статистически значимо подобрение в нормализираната зона на LacZ трансдукция в трахеята с използването на магнит (*p = 0,029, t-тест, n = 3 за група, средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност).
Неутралните бързо оцветени в червено срезове (пример, показан на допълнителна фигура 2) показват, че оцветените с LacZ клетки присъстват в същата проба и на същото място, както беше докладвано по-рано.
Ключовото предизвикателство в генната терапия на дихателните пътища остава прецизното локализиране на частиците носители в областите на интерес и постигането на високо ниво на ефективност на трансдукция в подвижния бял дроб при наличие на въздушен поток и активно изчистване на слуз.За LV носители, предназначени за лечение на респираторни заболявания при кистозна фиброза, увеличаването на времето на престой на частиците носители в проводимите дихателни пътища досега беше непостижима цел.Както е посочено от Castellani et al., използването на магнитни полета за подобряване на трансдукцията има предимства пред други методи за доставяне на гени като електропорация, тъй като може да комбинира простота, икономичност, локализирано доставяне, повишена ефективност и по-кратко време на инкубация.и евентуално по-ниска доза носител10.Въпреки това, in vivo отлагането и поведението на магнитни частици в дихателните пътища под въздействието на външни магнитни сили никога не е било описано и всъщност способността на този метод да повишава нивата на генна експресия в непокътнати живи дихателни пътища не е демонстрирана in vivo.
Нашите in vitro експерименти на PCXI синхротрона показаха, че всички частици, които тествахме, с изключение на полистирола MP, бяха видими в настройката за изображения, която използвахме.При наличие на магнитно поле, магнитните полета образуват струни, чиято дължина е свързана с вида на частиците и силата на магнитното поле (т.е. близостта и движението на магнита).Както е показано на фигура 10, струните, които наблюдаваме, се формират, когато всяка отделна частица се магнетизира и индуцира собствено локално магнитно поле.Тези отделни полета карат други подобни частици да се събират и свързват с групови движения на струни поради локални сили от локалните сили на привличане и отблъскване на други частици.
Диаграма, показваща (a, b) вериги от частици, образуващи се вътре в пълни с течност капиляри и (c, d) пълна с въздух трахея.Имайте предвид, че капилярите и трахеята не са начертани в мащаб.Панел (a) също съдържа описание на МФ, съдържащ Fe3O4 частици, подредени във вериги.
Когато магнитът се премести над капиляра, ъгълът на низа от частици достигна критичния праг за MP3-5, съдържащ Fe3O4, след което низът от частици вече не остана в първоначалното си положение, а се премести по повърхността до нова позиция.магнит.Този ефект вероятно възниква, защото повърхността на стъклената капилярка е достатъчно гладка, за да позволи това движение да се случи.Интересното е, че MP6 (CombiMag) не се държеше по този начин, може би защото частиците бяха по-малки, имаха различно покритие или повърхностен заряд или патентованата носеща течност повлия на способността им да се движат.Контрастът в изображението на частиците CombiMag също е по-слаб, което предполага, че течността и частиците могат да имат еднаква плътност и следователно не могат лесно да се движат една към друга.Частиците също могат да се заклещят, ако магнитът се движи твърде бързо, което показва, че силата на магнитното поле не винаги може да преодолее триенето между частиците в течността, което предполага, че силата на магнитното поле и разстоянието между магнита и целевата област не трябва да изглеждат като изненада.важно.Тези резултати също така показват, че въпреки че магнитите могат да уловят много микрочастици, протичащи през целевата област, малко вероятно е да се разчита на магнитите, за да придвижват CombiMag частици по повърхността на трахеята.По този начин стигнахме до заключението, че in vivo изследванията на LV MF трябва да използват статични магнитни полета за физическо насочване към специфични области на дървото на дихателните пътища.
След като частиците бъдат доставени в тялото, те са трудни за идентифициране в контекста на сложната движеща се тъкан на тялото, но способността им за откриване е подобрена чрез преместване на магнита хоризонтално над трахеята, за да „мърда“ MP струните.Докато изображенията в реално време са възможни, е по-лесно да се различи движението на частиците, след като животното е било хуманно убито.Концентрациите на MP обикновено са най-високи на това място, когато магнитът е позициониран над зоната за изобразяване, въпреки че някои частици обикновено се намират по-надолу в трахеята.За разлика от in vitro изследванията, частиците не могат да бъдат завлечени надолу по трахеята чрез движението на магнит.Това откритие е в съответствие с начина, по който слузта, която покрива повърхността на трахеята, обикновено обработва вдишаните частици, като ги улавя в слузта и впоследствие ги изчиства чрез механизма на муко-цилиарния клирънс.
Ние предположихме, че използването на магнити над и под трахеята за привличане (фиг. 3b) може да доведе до по-равномерно магнитно поле, а не до магнитно поле, което е силно концентрирано в една точка, което потенциално води до по-равномерно разпределение на частиците..Въпреки това, нашето предварително проучване не намери ясни доказателства в подкрепа на тази хипотеза.По същия начин, настройването на двойка магнити за отблъскване (фиг. 3c) не доведе до повече утаяване на частици в областта на изображението.Тези две констатации показват, че настройката с двоен магнит не подобрява значително локалния контрол на MP насочването и че получените силни магнитни сили са трудни за настройка, което прави този подход по-малко практичен.По същия начин, ориентирането на магнита над и през трахеята (Фигура 3d) също не увеличава броя на частиците, оставащи в изобразената област.Някои от тези алтернативни конфигурации може да не са успешни, тъй като водят до намаляване на силата на магнитното поле в зоната на отлагане.По този начин конфигурацията с единичен магнит при 30 градуса (фиг. 3а) се счита за най-простият и най-ефикасен in vivo метод за тестване.
Проучването LV-MP показа, че когато LV векторите се комбинират с CombiMag и се доставят, след като са били физически обезпокоени в присъствието на магнитно поле, нивата на трансдукция се увеличават значително в трахеята в сравнение с контролите.Въз основа на проучвания за синхротронно изображение и резултати от LacZ, изглежда, че магнитното поле е в състояние да задържи LV в трахеята и да намали броя на векторните частици, които незабавно проникват дълбоко в белия дроб.Такива подобрения на насочване могат да доведат до по-висока ефективност, като същевременно намаляват доставените титри, нецелевата трансдукция, възпалителните и имунните странични ефекти и разходите за трансфер на гени.Важно е, че според производителя CombiMag може да се използва в комбинация с други методи за генен трансфер, включително други вирусни вектори (като AAV) и нуклеинови киселини.